葛淑敏，薛小慧，孔夢玉，崔 霞，葉曉宇，王長娟，武金寶

(1.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院2020級碩士研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所)

大腸癌(Colorectal cancer，CRC，包括結(jié)腸癌和直腸癌)，屬腸黏膜上皮惡性腫瘤。隨著人們生活水平的提高，營養(yǎng)攝入豐富且過于精細，CRC的發(fā)病率整體是呈上升趨勢[1]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，在我國CRC已排在癌癥致死因素和惡性腫瘤的第5位，且逐漸年輕化[2]。CRC患者壽命預期與其診斷密切相關(guān)，晚期CRC根治性切除術(shù)后5年的生存率小于5 %，而早期CRC可達90 %以上，大大提高患者的存活率[3-4]。因此，早期CRC的診斷也成為臨床工作的迫切需要。早期CRC限于黏膜和黏膜下層，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這也表示初期并沒有特異性的癥狀，很難引起患者防患意識，往往就診時腫瘤已發(fā)展為中晚期，這無形中加重治療和經(jīng)濟負擔。CRC的早期診斷至關(guān)重要,尤其是對高危人群進行篩查。當前我國共識的高危人群包括：(1)大便隱血陽性者；(2)直系親屬大腸癌病史；(3)家族性腺瘤病史；(4)曾患其他癌癥史；(5)精神、營養(yǎng)慢性腹瀉及感染病史[3]。目前臨床上常用的檢測手段有：直腸指診、大便潛血試驗、內(nèi)鏡(電子結(jié)腸鏡、纖維結(jié)腸鏡，值得注意的是，擴大電子結(jié)腸鏡和超聲大腸鏡不僅具備普通內(nèi)鏡優(yōu)點，還可判斷腫瘤對周圍組織的侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以便更加清楚地觀察病變處[5])、脫落細胞學檢查(簡單易行，對于早期CRC意義重大)、早期CRC基因診斷等[6]。隨著近些年來分子生物學的發(fā)展，逐漸揭開CRC是一種多基因多步驟發(fā)展性的腫瘤，抑癌基因的失活和原癌基因激活都會導致其編碼的蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，進而影響其生物活性[7]。測定CRC密切聯(lián)系的P53、DCC、APC、RAS家族等基因有助于早期CRC的診斷。研究早期CRC基因診斷是為了尋找具有敏感性和特異性強的腫瘤標志物，尤其是家族性遺傳CRC，早期診斷早期治療，是解決問題之根本。本文簡介早期CRC主要基因診斷進展。

1 P53 基因

1.1P53基因的結(jié)構(gòu)和功能 人類P53基因位于17號染色體(17P13.1)，屬人體重要抑癌基因，也稱為基因組衛(wèi)士[8]，由10個內(nèi)含子和11個外顯子構(gòu)成，主要存在細胞核內(nèi)，其主要分型為野生型(Wt-P53)和突變型(Mt-P53)。20世紀70年代首次發(fā)現(xiàn)，四十年間對其研究不斷加深。目前認為Wt-P53編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，控制和監(jiān)測正常細胞的周期。P53的轉(zhuǎn)錄機制是通過P1啟動子和P2啟動子控制的。P1位于第一外顯子的上游，P2位于第一內(nèi)含子上，P1結(jié)合位點包括AP1相關(guān)蛋白及NF1蛋白，需要內(nèi)含子進行正調(diào)節(jié)，而Wt-P53之所以會被稱為抑癌基因，通過抑制細胞增殖，致使細胞凋亡[9-13]。目前還發(fā)現(xiàn)P53基因會與一些病毒和細胞蛋白結(jié)合形成新的復合物[14]。Green[15]通過實驗表明突變后P53會抑制野生型P53，與其競爭與底物結(jié)合，致細胞周期異常和癌化發(fā)展。Scheffner等學者[16]發(fā)現(xiàn)，人HPV病毒E6蛋白與P53結(jié)合后，致使wtP53迅速溶解，并且還能通過阻斷SV 40 T抗原與DNA聚合酶a結(jié)合，從而抑制SV DNA的復制，這也說明P53可能還作用于某些細胞內(nèi)靶蛋白，從而起抑制作用，進而闡述P53可能對細胞生長是抑制作用。P53基因在細胞中的作用復雜且多樣，尤其突變后，很多機制仍不明確，隨著分子生物學發(fā)展，P53也會成為腫瘤治療和早期診斷的重要靶點。

1.2P53基因與CRC P53通過突變和點缺失、過度表達在上皮細胞。抑癌基因P53的突變多種多樣，mtP53主要是與wtP53競爭并抑制其活性，加快腫瘤細胞的生長。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)Mt-P53在大腸癌中檢測率可為50 %，可用于CRC早期診斷、分級、分期及預后判斷。詹義鳳[17]主要應用免疫組化的方法檢測正常腸組織、大腸低分化腺瘤、大腸高分化腺瘤及大腸癌組織中Mt-P53的表達率，其呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，各組陽性表達有顯著差異(P<0.05)，在大腸癌前病變和早期大腸癌階段，Mt-P53高表達，常提示患者的病變處于進展期。P53的突變和過度表達可以作為臨床早期腺瘤良惡性的鑒別手段。同時陳康部[18]通過對大腸癌、大腸腺瘤和正常大腸組織中的Mt-P53進行檢測，分別為74.00 %、62.00 %、0，陽性表達率明顯減少(P<0.05)，說明P53在大腸早期發(fā)生癌變時會發(fā)生正相關(guān)的升高，并且P53還與浸潤深度、分化及分期相關(guān)，T2、T3和T4的P53表達率高于T1(P< 0.05)，Dukes分期越高P53的表達率越高。根據(jù)不同學者的研究均發(fā)現(xiàn)，P53的表達在大腸癌患者體內(nèi)，癌變越嚴重值越高，并且浸潤深度和分期密切相關(guān)[19]。說明P53在大腸癌發(fā)生和發(fā)展起到重要作用，通過檢測P53的表達率，早期發(fā)現(xiàn)腺瘤或者潰瘍有癌變傾向，進行臨床治療可以大大減輕患者負擔和痛苦。鄭艷清等[20]收集149散發(fā)性結(jié)直腸癌標本與149份正常大腸組織對照組，采用對大腸癌組織標本進行微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)檢測和免疫組化后，結(jié)果顯示癌組標本Mt-P53蛋白的表達率可達67.1 %，高于正常組，因此可通過檢測P53了解結(jié)直腸癌的預后效果、惡化程度及治療，并發(fā)現(xiàn)錯配修復(MMR)引起的基因異常。微衛(wèi)星不穩(wěn)定可為結(jié)直腸新機制提供很多新的研究方向。P53的研究意義和臨床價值會為早期CRC患者會帶來重大福音，同時為分子水平的靶向治療提供新思路。

2 APC基因

2.1APC基因的結(jié)構(gòu)和功能 APC(腺瘤性結(jié)腸息肉病)基因是1986年Herrera發(fā)現(xiàn)的一種可以抑制腫瘤的基因，其與腸息肉病有關(guān)[21]。Gtoden等人首次在結(jié)腸癌中分離并克隆出并給予命名。Shpitz[22]采用特異性DNA探針及PCR技術(shù)分離出APC位于染色體5q21-q22，8 538個核苷酸組成，可以編碼2 843個氨基酸，共有15個外顯子，第15號外顯子體積最大(約占81.3 %)、功能也是最復雜的[23]。APC基因編碼的蛋白質(zhì)成為APC蛋白，主要存在細胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，最重要的功能就是直接參與Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導途徑(激活核內(nèi)靶分子)。APC蛋白與GsK-3B、Axin等形成復合物來保證Wnt信號途徑對細胞特化、增值、極性以及遷移的正常調(diào)節(jié)[23-24]。APC基因一旦發(fā)生變異，上述復合物不會形成，最終會導致Wnt/β-catenin通路保持激活狀態(tài)，β-catenin無法代謝聚集在胞質(zhì)內(nèi)，進而細胞無節(jié)制增生，啟動大腸腺瘤細胞增殖及癌變[23、25-26]。Fodde等[27]建立敲掉部分ACP基因的老鼠模型，給予刺激因素，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸未見腺瘤產(chǎn)生。APC基因的突變可以在任何區(qū)域，變異后編碼的蛋白不同，表現(xiàn)在大腸上的腺瘤形態(tài)也不同，主要集中在第15號外顯子的5’ 段MCR區(qū)域，國內(nèi)外學者報道MCR區(qū)域的突變率在28 %～48.8 %左右[28-29]。APC基因突變常見于家族性腺瘤性息肉病(FAP)，是常染色體顯性遺傳病，家族基因一旦攜帶變異性APC基因，發(fā)病率極高，常以多發(fā)出現(xiàn)。

2.2APC基因與CRC 大多數(shù)的癌前病變都與APC基因的變異表達和缺失有關(guān)，屬于CRC最早期表現(xiàn)，首先發(fā)現(xiàn)在FAP，后發(fā)現(xiàn)在散發(fā)的CRC中也起到很大的作用[30]。APC突變形式包括移碼突變和點突變，前者編碼出無效的截短APC蛋白[31]。楊春等[32]收集已確診為大腸腺瘤(排除家族性)、大腸癌和正常組織組織標本，采用蛋白截短檢測方法，結(jié)果顯示，APC蛋白截短分別為42.86 %、47.06 %和0，正常組織與大腸腺瘤、CRC有明顯差異(P=0.001)，管狀腺瘤明顯高于絨毛腺瘤和混合腺瘤(P<0.05)，提示變異性APC在大腸的內(nèi)皮發(fā)生瘤變出現(xiàn)，即由腺瘤發(fā)展為癌的過程中也是一直存在，APC蛋白的截短可以作為診斷早期CRC的標準。相關(guān)學者也發(fā)現(xiàn)APC蛋白的截短還與腺瘤的分型有指導作用[33]。趙龍等[34]分析了120例大腸癌術(shù)后標本，采用二代測序技術(shù)檢測APC基因在16號外顯子的突變，結(jié)果顯示，在肝轉(zhuǎn)移的患者APC的變異率高于非肝轉(zhuǎn)移者(χ2=5. 789,P=0.016)，處于T4突變率明顯高于非T 4期患者(χ2=4. 144,P= 0. 042 )。劉志貞等[35]研究早期診斷腺瘤和CRC時，通過糞便檢測APC基因發(fā)現(xiàn)，兩者中APC基因存在較大差距。糞便檢測APC基因操作簡單便捷，可適用于早期CRC的診斷。現(xiàn)在多種不同的研究顯示，通過早期基因檢測大腸癌細胞缺乏正常APC蛋白，治療過程中添加APC蛋白可對腫瘤細胞的生長起到抑制的作用，未來研究找到相關(guān)靶點及敏感的腫瘤標志物，可在分子生物學角度對大腸癌早診斷早治療。

3 DCC基因

3.1DCC基因的結(jié)構(gòu)與功能 DCC基因于20世紀由Fearon等[36]對大腸癌組織定位克隆發(fā)現(xiàn)并確認的，位于染色體18q21.3，全長370 kb。DCC基因編碼的蛋白屬于跨膜蛋白，其外部的細胞粘附分子和氨基酸序列與其它相關(guān)的細胞表面的糖蛋白的氨基酸序列高度同源，也就具有類細胞粘附作用，通過在胚胎發(fā)育分化和介導細胞間、細胞與間質(zhì)間的相互作用，進而影響細胞的生長、分化和信息傳遞，如果DCC基因缺失會導致細胞分化異常，細胞向瘤化生長[37-38]。 Keino-Masu等[39]發(fā)現(xiàn)DCC蛋白可能還介導神經(jīng)軸突發(fā)育的Netrin-1部分受體，該受體大多數(shù)正常上皮都可以表達，但是一旦上皮組織發(fā)生癌變傾向，表達會明顯減少。目前共識DCC減少主要是由于基因丟失和啟動子甲基化。姜洪偉等[40]檢測大腸癌DCC基因啟動子甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，甲基化頻率與腫瘤組織分化程度、分期密切相關(guān)(P< 0.05)。DCC基因在細胞內(nèi)的功能還有很多機制不明，與眾多器官組織的癌變相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)DCC基因表達缺失還與胃癌[41]、子宮內(nèi)膜癌[42]、卵巢癌[43]等相關(guān)，可以作為生物學標志物來診斷早期癌變的發(fā)生。

3.2DCC基因與CRC 作為人體最大的抑癌基因，DCC基因在正常情況下對我們的大腸起到保護作用。張慧晶[44]等發(fā)現(xiàn)，組織、不典型增生組織、炎性組織及癌旁正常組織DCC的表達逐漸升高，即癌組織中DCC蛋白明顯少于正常組織，這種失表達可能推進早期CRC的發(fā)生。同時張慧等[45]通過對比60例CRC及其癌旁正常組織，結(jié)果顯示，DCC蛋白在癌組織中的表達為20.0 %，癌旁正常組織為96.7 %，兩者對比差異十分明顯(P<0.05)，說明DCC基因的缺失表達與CRC的出現(xiàn)是正相關(guān)的。多位學者研究均發(fā)現(xiàn)，DCC基因發(fā)生改變是CRC早期事件，也是一個重要的促發(fā)因素。DCC基因的失活主要是因為等位丟失，所編碼出的變異DCC蛋白刺激CRC分化和分期等，與APC相同的是，它的變異后編碼產(chǎn)物也是伴隨整個CRC階段。套格蘇等[46]采用PCDNA3.1(+)- DCC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸癌裸鼠上，結(jié)果顯示DCC蛋白含量降低，并且癌組織中的淋巴管減少和瘤重少有減輕，說明DCC基因通過誘導細胞凋亡并且抑制癌細胞的生長增殖，這與國外學者Castes等[47]研究發(fā)現(xiàn)一致，DCC可以作為腫瘤生長的抑制劑，誘導癌細胞凋亡。李圓圓等[48]研究發(fā)現(xiàn)APC基因的變異發(fā)生在瘤變初形成階段，DCC基因的變異是在瘤變中期向晚期發(fā)展的階段，略晚于APC，證實了CRC早期是個多基因介導的疾病。

4 K-RAS基因

4.1K-RAS基因的結(jié)構(gòu)與功能 RAS基因家族包括K-Ras、N-Ras和H-Ras，作用廣泛，人體內(nèi)大多數(shù)細胞都可以表達[49]。K-Ras位于常染色體12q12.1，含有4個編碼外顯子和1個5’端非編碼外顯子，共同編碼含189個氨基酸的RAS蛋白，也稱為p21蛋白[49-50]。K-Ras蛋白是由膜結(jié)合型的三磷酸鳥苷(GTP)/二磷酸鳥苷(GDP)結(jié)合后的蛋白，簡單來說就是GTP酶，將GTP轉(zhuǎn)化為GDP，當Ras蛋白受到影響某些影響細胞發(fā)育和成熟的因子誘導后激活，會把細胞膜表面的表皮生長因子(ECFR)和一些激素遞質(zhì)傳遞到細胞核，而后迅速失活，傳遞停止[49]。K-Ras蛋白參與的最重要通路就是RAS-MAPK，作用機制復雜。國內(nèi)外有很多學者研究這一通路，目前公認該通路主要傳遞信息，參與細胞整個發(fā)育階段包括凋亡[49，51]。上述的K-Ras的功能是野生型K-Ras，K-Ras基因發(fā)生突變或過度表達后K-Ras蛋白的功能紊亂，會導致細胞異常生長，出現(xiàn)癌變傾向，成為CRC的致癌基因，亞洲人突變的率為29 %-62.9 %[52]。有部分學者認為K-Ras本就是原癌基因，在大腸癌中其突變后表達率和野生型差不多[53]。突變型K-Ras主要是在外顯子23和4。周楠[54]通過87例結(jié)直腸癌患者組織，進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)尤其是2號外顯子第12、13密碼子突變最常見。突變型的K-Ras可以持續(xù)激活RAS- MAPK通路，促進腫瘤細胞無限增長，影響CRC分化[55]。

4.2K-RAS基因與CRC 在CRC初始階段是最常見的原癌基因改變K-RAS基因的突變，在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到啟動和促進作用[56]。詹俊[57]等收集31例大腸癌、26例大腸腺瘤和27例正常對照組患者的糞便和血液進行DNA的提取，后PCR擴增，結(jié)果顯示，糞便K-Ras基因突變在大腸癌、腺瘤和正常對照組分別為54.8 %、7.7 %、0 %，大腸癌標本遠高于正常的標本(P<0.05)，血液中分別為48.4 %、3.8 %、0 %，血液中大腸癌組也是高于正常的標本(P<0.05)，即K-Ras基因突變主要發(fā)生在大腸癌時期，特異性也比較高，血液和糞便聯(lián)合監(jiān)測可作為早期CRC無創(chuàng)的篩查方法。馬其釗等[58]研究發(fā)現(xiàn)K-Ras基因突變與CRC的分化程度相關(guān)，與浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，表明K-Ras的突變也是屬于大腸癌的早期癌變因素。韋汝珍[59]對375例大腸癌患者進行K-Ras變異率的基因檢測，目的是做出基因診斷和靶向治療。西妥昔單抗治療野生型K-Ras基因大腸癌患者敏感，而對突變型無效反而增加藥物的毒性，說明K-Ras基因不僅可以用于早期CRC診斷，而且還可以用于中、晚期CRC輔助治療。

5 小結(jié)與展望

目前診斷早期大腸癌的方法眾多，但是總體檢出率并不高，大都是疾病已經(jīng)發(fā)展到一定的階段，有明顯的臨床表現(xiàn)后才能得到診斷和治療，無形中增加了患者和國家的負擔。隨著分子生物學的發(fā)展，對大腸癌發(fā)病機制及致病基因不斷研究認識，可以通過基因檢測輔助內(nèi)鏡增加檢出率或是發(fā)現(xiàn)敏感的早期大腸癌腫瘤標志物等。在組織發(fā)生癌變傾向時，會有基因方面的改變，這為基因研究提供理論依據(jù)[60]。還有很多基因的致病機制及突變的靶點仍在探索中。研究早期大腸癌的基因診斷是十分有必要的，一方面可以提高檢出率，另一方面發(fā)現(xiàn)個體化的靶向治療。