林塏皓 任枚琪 王聯(lián)通 史瀟

精子DNA損傷是指精子在生成及成熟過程中產(chǎn)生的單鏈和（或）雙鏈的DNA 損傷［1］。研究證明，精子DNA 碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI） 與輔助生育后的妊娠率及流產(chǎn)率顯著相關(guān)［2-3］，因此DFI被認(rèn)為是評估男性生育能力的有效新指標(biāo)［4］。檢測DFI 的方法多種多樣，其中精子染色質(zhì)擴(kuò)散實驗（sperm chromatin dispersion test，SCD）檢測技術(shù)簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性高、不需要特殊設(shè)備、價格便宜、結(jié)果判讀容易，已被廣泛應(yīng)用于生殖男科學(xué)臨床［1，5］。然而近年來有研究指出，SCD實驗測出的DFI與妊娠結(jié)局相關(guān)性不高［6-7］，因而有學(xué)者開始質(zhì)疑其應(yīng)用價值。SCD不僅能夠檢測總的精子DNA 碎片率（即DFI），還可根據(jù)精子暈環(huán)大小細(xì)分出：大暈環(huán)精子，中暈環(huán)精子，小暈環(huán)精子，無暈環(huán)精子以及退化精子。精子暈環(huán)大小可以反映精子DNA 的損傷程度，精子暈環(huán)越大說明精子DNA受損傷程度越輕［8］，根據(jù)各類型暈環(huán)精子百分比可進(jìn)一步對精子DNA損傷程度進(jìn)行評估。有研究指出，與總DFI 相比，SCD 實驗中的大暈環(huán)精子百分比對胚胎質(zhì)量及妊娠的預(yù)測價值更高［9-10］。也有研究報道，反映精子DNA嚴(yán)重?fù)p傷和凋亡的無暈環(huán)及退化精子百分比較總DFI 更能有效地預(yù)測輔助生殖的妊娠結(jié)局［6］。然而目前SCD 細(xì)化分類與精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性仍不明確，其臨床意義的解讀尚未完善。為此，本文對281 例男性SCD 結(jié)果及精液常規(guī)參數(shù)進(jìn)行了回顧性分析，旨在探索兩者之間的關(guān)系，為SCD細(xì)化解讀提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

研究對象為2017年6月至2019年6月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖中心就診行SCD及精液常規(guī)檢查的281名男性。

二、精液常規(guī)分析

手淫法獲取精液樣本后，置于取精杯內(nèi)37 ℃恒溫保存。待精液完全液化并充分混勻后采用西班牙SCA 公司的計算機輔助精液常規(guī)分析（computerassisted sperm analysis，CASA）系統(tǒng)，依據(jù)世界衛(wèi)生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版檢測標(biāo)準(zhǔn)，對患者精子濃度、前向運動精子百分比、非前向運動精子百分比、不動精子百分比等精液常規(guī)參數(shù)進(jìn)行分析。精子形態(tài)學(xué)分析采用Diff-Quik法染色后，依據(jù)Strict標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。

三、SCD實驗

SCD 檢測原理為：在酸變性和去除核蛋白后，DNA 無損傷的精子染色質(zhì)可擴(kuò)散形成特征性的暈環(huán)，DNA受到損傷的精子則產(chǎn)生很小的暈環(huán)或無暈環(huán)產(chǎn)生［5］。本研究采用安徽安科生物的SCD 試劑盒對精子DNA損傷程度進(jìn)行檢測。簡要步驟為：PBS緩沖液將精液標(biāo)本濃度稀釋至（5～10）× 106/mL；取60 μL 稀釋后的精液標(biāo)本與低熔點瓊脂糖凝膠混勻，接著取10 μL 瓊脂糖混合液滴到預(yù)處理過的載玻片上，蓋上蓋玻片；將玻片置于4 ℃冰箱中5 min，隨后去掉蓋玻片；并將載玻片放入鹽酸中處理7 min，置于裂解液中處理25 min，雙蒸水浸泡洗滌5 min，然后用75%、95%、100%乙醇各脫水2 min；空氣干燥后，用瑞氏-吉姆薩染色15 min；雙蒸水清洗后顯微鏡觀察，每個標(biāo)本多視野觀察400 條精子，記錄不同暈環(huán)類型的精子所占百分比。精子DNA 損傷程度按Fernández 標(biāo)準(zhǔn)［8］分為：①大暈環(huán)精子，即精子暈環(huán)直徑≥精子核最大橫徑；②中暈環(huán)精子，即精子暈環(huán)介于大小暈環(huán)之間；③小暈環(huán)精子，即精子暈環(huán)直徑≤精子核最大橫徑的1/3；④無暈環(huán)精子，即核外周無暈環(huán)的精子；⑤退化精子，即核外周無暈環(huán)且染色明顯變淺的精子?？侱FI 計算方法為（小暈環(huán)精子數(shù)+無暈環(huán)精子數(shù)+退化精子數(shù)）/計數(shù)精子總數(shù)。大、中、小、無暈環(huán)精子及退化精子百分比為各類型暈環(huán)的精子占總計數(shù)精子的百分比。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，描述統(tǒng)計資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）、中位數(shù)（median）、第25 及75 百分位數(shù)（25thpercentile，75thpercentile）來表示。依據(jù)各類型暈環(huán)精子百分比及總DFI的中位數(shù)進(jìn)行分組，小于和等于中位數(shù)者分為A組，大于中位數(shù)者分為B組。采用兩獨立樣本t檢驗比較各類型暈環(huán)及DFI中A、B兩組間精液常規(guī)參數(shù)的差異，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對象的一般資料、精液參數(shù)及SCD結(jié)果

研究對象的基本狀況、精液參數(shù)及SCD結(jié)果詳見表1。研究對象的年齡平均為（36.0±5.9）歲；禁欲時間平均4.4天；精液PH平均為7.46；精液量平均為2.77 mL；精子濃度平均為52.89×/mL；前向運動精子百分率平均為37.61%，非前向運動精子百分率平均為11.64%，不動精子百分率平均為50.67%；精子正常形態(tài)百分率平均為3.20%。SCD結(jié)果中，大暈環(huán)、中暈環(huán)、小暈環(huán)、無暈環(huán)、退化精子百分比以及總DFI 的中位數(shù)依次為45.0%、42.5%、4.0%、3.0%、4.0%和12.0%。

表1 281名研究對象一般資料、精液參數(shù)及SCD結(jié)果

二、各類型暈環(huán)精子百分比及DFI 的A 組與B組間精液常規(guī)參數(shù)比較

各類型暈環(huán)精子百分比及DFI 的A 組與B 組間精液常規(guī)參數(shù)比較見表2。結(jié)果提示：大暈環(huán)A 組前向運動精子百分比顯著低于B 組［（34.00±19.07）%vs（41.35±18.78）%，P= 0.001］，大暈環(huán)A 組不動精子百分比顯著高于大暈環(huán)B 組［（54.72±20.75）%vs（46.46±20.83）%，P=0.001）］。而在中暈環(huán)、小暈環(huán)、無暈環(huán)、退化精子及DFI 的A 組與B 組間精液常規(guī)參數(shù)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 不同暈環(huán)類型及DFI 的A組與B組間精液常規(guī)比較

討 論

精子DNA是傳遞男性遺傳信息的載體。然而在精子生成、成熟及轉(zhuǎn)運過程中由于生殖細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)重塑及氧化應(yīng)激等原因可產(chǎn)生DNA斷裂，造成精子DNA 損傷。導(dǎo)致精子DNA 損傷的因素常常同時出現(xiàn)并互為因果。在精子生成過程中DNA需經(jīng)歷組蛋白組型轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生DNA缺口后染色質(zhì)才能夠獲得重塑和濃縮，從而保證精子DNA的穩(wěn)定性。若產(chǎn)生的DNA 缺口未能重新連接，將導(dǎo)致精子DNA斷裂和（或）觸發(fā)凋亡，造成精子DNA損傷［11］。若組蛋白組型轉(zhuǎn)化過程異常，則將導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮不足，精子DNA 更易受到活性氧攻擊而產(chǎn)生DNA 碎片［11］。另外，吸煙、飲酒、輻射、高齡、藥物、環(huán)境污染物以及某些疾?。ㄈ绺腥尽⒕黛o脈曲張、糖尿病、癌癥等）均可能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、凋亡和染色質(zhì)重塑障礙中一個或多個方面而導(dǎo)致精子DNA碎片的產(chǎn)生［11-12］。而精子DNA損傷程度的增加又會導(dǎo)致受精率、胚胎質(zhì)量和妊娠率降低，并增加流產(chǎn)率［2-3，13］。

目前在檢測精子DNA完整性的常用方法中，精子染色體結(jié)構(gòu)分析（sperm chromatin structure assay，SCSA）是金標(biāo)準(zhǔn)［12，14］。它的優(yōu)點在于靈敏度高，且具有固定、統(tǒng)一的閾值；缺點在于需要使用流式細(xì)胞儀，對實驗室條件要求較高，費用昂貴，并不適合基層開展工作，因而限制了其臨床推廣。SCD法是目前檢測精子DNA碎片操作最為簡單、精確、重復(fù)性高和廉價的方法，無需配備昂貴的實驗儀器。多項研究表明，SCD 和SCSA 的檢測結(jié)果具有顯著的相關(guān)性和一致性［15-17］。因此，SCD 法更適合基層醫(yī)院進(jìn)行臨床推廣。在既往的臨床應(yīng)用中，學(xué)者們大都關(guān)注于探索SCD 實驗的總DFI 指標(biāo)的臨床意義。然而近期有研究指出，SCD 檢測的總DFI 與妊娠結(jié)局無顯著相關(guān)性［6-7］，而大暈環(huán)精子百分比對妊娠結(jié)局的預(yù)測價值更高［9-10］。也有研究報道，與總DFI 相比，無暈環(huán)和退化精子百分比也可能更為有效地預(yù)測輔助生殖的妊娠結(jié)局［6］。因此，逐漸有學(xué)者開始關(guān)注SCD檢測結(jié)果中各類型暈環(huán)精子百分率在臨床上的應(yīng)用價值。但是目前SCD細(xì)化分類與精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性仍不明確，其臨床意義的解讀尚未完善，故有必要對此進(jìn)行深入研究。

本研究首次對男性精子SCD檢測結(jié)果中各類型暈環(huán)精子百分比和精液常規(guī)數(shù)據(jù)之間的關(guān)系進(jìn)行研究。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：大暈環(huán)百分比大于中位數(shù)的男性前向運動精子百分比顯著高于大暈環(huán)百分比小于和等于中位數(shù)者，而其不活動精子百分比顯著低于大暈環(huán)百分比小于和等于中位數(shù)者。由于大暈環(huán)精子代表精子DNA 完整性最好的一類精子［8，10］，本文研究結(jié)果提示：大暈環(huán)精子百分比與精子運動能力關(guān)系密切，輕微的精子DNA損傷即可造成精子運動能力的顯著下降。其機制可能與精子DNA損傷使線粒體呼吸代謝功能下降，進(jìn)而導(dǎo)致精子鞭毛運動能力減弱有關(guān)［18］。此外，有研究指出精子DNA損傷的增加可反映活性氧類物質(zhì)水平的升高［19］。由于精子膜含有高濃度的不飽和脂肪酸，極易受到氧化應(yīng)激的損傷，引起精子膜脂質(zhì)過氧化［20］，進(jìn)而導(dǎo)致膜流動性和完整性下降、軸絲蛋白磷酸化水平降低，從而進(jìn)一步引起精子活力下降［21］。另外，某些活性氧類物質(zhì)（如H2O2）還可損傷酶活性（如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）并降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）在細(xì)胞內(nèi)的利用率，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)（如還原性谷胱甘肽）減少，進(jìn)而加重精子膜磷脂過氧化［21-22］，從而加劇精子運動能力的損傷。而精液參數(shù)的異?？赡苡删覦NA損傷進(jìn)一步影響導(dǎo)致，也可能是由某一致病因素導(dǎo)致，與DNA 碎片并無相關(guān)，精子DNA的完整性分析可以作為精液常規(guī)檢測的補充。因此作者推測：大暈環(huán)精子百分比可能是反映精子DNA損傷的最敏感指標(biāo)，其下降可能提示著精子氧化損傷的增加及線粒體呼吸代謝功能的下降，可進(jìn)一步導(dǎo)致精子運動能力的降低。此外，由于精子運動能力與精子功能密切相關(guān)［23］，作者的研究結(jié)果也提示：精子DNA損傷檢測可能能夠反映精子的受精能力和胚胎發(fā)育情況。Tandara M 等［10］研究發(fā)現(xiàn)預(yù)測IVF 治療后胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局時，大暈環(huán)精子百分比是比DFI 更好的預(yù)測參數(shù)，大暈環(huán)精子百分比越高妊娠率越高。說明精子DNA碎片程度可能與精子受精能力和胚胎發(fā)育有關(guān)。盡管Braude P等［24］指出，胚胎基因組只有在4～8細(xì)胞期才開始表達(dá)，因而卵母細(xì)胞在受精后原核形成和早期卵裂可能不受精子DNA完整性的影響。然而，若精子DNA 碎片過高，超過了卵母細(xì)胞修復(fù)精子DNA 損傷的能力，則可能會影響進(jìn)一步的胚胎發(fā)育［25-27］。據(jù)此作者推測：大暈環(huán)精子所占比例越高，反映著精子質(zhì)量越好，更容易實現(xiàn)受精、妊娠和胚胎順利發(fā)育。

本研究中發(fā)現(xiàn)DFI 的A 組與B 組間的精液常規(guī)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明DFI 的不同亞組間精液常規(guī)參數(shù)無顯著差異。既往Sun TC 等［7］采用SCD檢測精子DNA碎片，采用相關(guān)分析檢測DFI與精液參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)DFI 除與前向運動精子率呈顯著負(fù)相關(guān)外，與其余精液參數(shù)無相關(guān)性。然而，另有不少學(xué)者相關(guān)分析的結(jié)果提示，DFI 與精子濃度、前向運動精子率、正常形態(tài)精子率存在顯著負(fù)相關(guān)［6，15，28］。該結(jié)果與既往研究略有差異，可能是因為研究群體的差異、精液參數(shù)分析方法不同、分組和統(tǒng)計方式不同等因素造成的。盡管如此，在本研究中，DFI 與所有的精液常規(guī)參數(shù)無關(guān)，而代表精子DNA 完整性最好的大暈環(huán)精子百分比的降低與PR%的降低和IM%的增加有關(guān)，這提示與DFI 相比，大暈環(huán)精子百分比能更敏感地反映精子的運動效能。

綜上，本研究首次對SCD檢測結(jié)果中精子暈環(huán)大小對常規(guī)精液參數(shù)的影響進(jìn)行了分析，深入探討了細(xì)化SCD分類結(jié)果的應(yīng)用價值，發(fā)現(xiàn)大暈環(huán)精子百分比較高的男性精子運動參數(shù)也更好。這說明大暈環(huán)精子百分比在一定程度上反映了精子的運動效能，輕微的精子DNA損傷均可導(dǎo)致精子運動能力的大幅下降。與精子總DFI 相比，SCD 細(xì)化分類更能夠讓臨床醫(yī)生了解患者精子DNA損傷的程度。因此各類暈環(huán)精子所占比值可能是比DFI 更有價值的評估參數(shù)，值得臨床推廣。