郭婷婷, 胡 錦, 朱雙圓, 李 明, 孟宇晨, 黃軍海*

(1. 上海工程技術(shù)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620； 2. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

隨著烈性傳染病的有效控制和人類平均壽命的延長(zhǎng)，癌癥已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一[1]。靶向治療是現(xiàn)代腫瘤治療的重要手段，VEGFR(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor)是該類靶向治療藥物的代表性靶點(diǎn)。已上市的VEGFR抑制劑結(jié)構(gòu)母核大致可以分為5類： (1)以Sorafenib為代表的二芳基脲類[2]； (2)以Sunitunib為代表的吲哚酮類[3]； (3)以Vandetanib為代表的喹唑啉類； (4)以Lenvatinib為代表的喹啉類[5]； (5)其他類，如Axitinib[6]。

對(duì)這些VEGFR抑制劑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)主要為平面剛性(如Lenvatinib)或相對(duì)柔性(如Sorafenib)結(jié)構(gòu)，而半剛性平面扭曲結(jié)構(gòu)母核較為欠缺。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，喹唑啉母核N原子與VEGFR受體有氫鍵作用，吲哚酮羰基結(jié)構(gòu)與亞胺結(jié)構(gòu)均可與VEGFR受體形成氫鍵[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道“蝶啶-7(8H)-酮”母核對(duì)多腫瘤細(xì)胞系有一定的抑制作用[8]，本研究對(duì)該半剛性結(jié)構(gòu)母核2-位、6-位和8-位進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成8個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的羰基蝶啶類抗腫瘤衍生物(TM1～TM8)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H NMR，13C NMR和LC-MS(ESI)表征。初步對(duì)多種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抗增殖活性研究，發(fā)現(xiàn)化合物TM1顯示出較好的抗腫瘤活性，本研究為該類半剛性結(jié)構(gòu)母核抗腫瘤藥物的研究提供參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

化合物TM1～TM8的合成路線：以2,4-二氯-5-硝基嘧啶(1)為起始原料，利用兩個(gè)氯原子活潑性差異先后兩步取代反應(yīng)得到化合物3a～3b；再經(jīng)過還原、關(guān)環(huán)得到化合物5a～5b；將5a～5b中甲硫醚氧化為亞砜得到中間體化合物6a～6b；嗎啉環(huán)是藥物中常用的結(jié)構(gòu)，可以提高藥物的水溶性，增加口服的可能性[9]，以嗎啉環(huán)取代亞砜得化合物7a～7b；再經(jīng)溴化得化合物TM1和TM2；以化合物TM1～TM2為原料，在堿性催化下得化合物TM3～TM4；通過Suzuki耦聯(lián)反應(yīng)得化合即TM5～TM6；與氨基化合物取代得化合物TM7～TM8(Scheme 1)。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WRS-18型數(shù)字熔點(diǎn)儀；Bruker 400 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Waters 2767/515/2489型液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Varioskan Flash 型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)2a～2b的合成(以2a為例[10])

在-25 ℃冷阱中，將2,4-二氯-5-硝基嘧啶(1)5.00 g(25.9 mmol)溶于THF(50 mL) 中，加入DIPEA 10 mL(51.8 mmol)攪拌均勻后，加入環(huán)丙胺1.50 g(26.7 mmol)，攪拌1 h(TLC檢測(cè))。過濾反應(yīng)液中的白色固體，濾餅用乙酸乙酯洗滌(3×15 mL )，濾液減壓濃縮，加入乙酸乙酯(3×200 mL) 和水(150 mL) 萃取，有機(jī)層以飽和NaCl水溶液(150 mL) 洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/20]純化得黃色固體2a3.70 g，收率65%；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.04(s, 1H), 8.34(s, 1H), 3.21～3.09(m, 1H), 1.08～1.00(m, 2H), 0.78～0.70(m, 2H)； LC-MS(ESI)m/z: 215.1{[M+H]+}。

2b：黃色固體，收率72%；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.02(s, 1H), 8.38(s, 1H), 4.67～4.53(m, 1H), 2.24～2.10(m, 2H), 1.87～1.75(m, 2H), 1.75～1.65(m, 2H), 1.62～1.48(m, 2H)； LC-MS(ESI)m/z: 243.1{[M+H]+}。

(2)3a～3b的合成(以3a為例[11])

稱取2a2.00 g(9.4 mmol)溶于THF(20 mL)中，加入甲硫醇鈉4.90 g(6.3 mmol， 20%水溶液)，攪拌(TLC監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完畢后，加60 mL水淬滅反應(yīng)，固體析出，過濾，濾餅經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(PE)/V(乙酸乙酯)=20/1]純化得黃色固體3a1.50 g，收率71%；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.98(s, 1H), 8.35(s, 1H), 3.16～3.00(m, 1H), 2.60(s, 3H), 1.00～0.90(m, 2H), 0.74～0.66(m, 2H)； LC-MS(ESI)m/z: 227.1{[M+H]+}。直接參與下步反應(yīng)。

(3)4a～4b的合成(以4a為例[12])

稱取鐵粉6.10 g(109.7 mmol) 與NH4Cl 2.90 g(54.8 mmol)溶解于EtOH(90 mL) 與(30 mL) 的混合溶液中，加熱至回流，攪拌1 h后，緩慢加入化合物3a6.20 g(27.4 mmol)，繼續(xù)攪拌0.5 h(TLC檢測(cè))。用硅藻土趁熱過濾，甲醇洗滌(3×30 mL)，濾液減壓濃縮后，用半飽和碳酸鈉水溶液(200 mL)與乙酸乙酯(3×300 mL)萃取，飽和NaCl溶液(150 mL) 洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干得紫紅色固體4a5.40 g，直接參與下一步反應(yīng)。

(4)5a～5b的合成(以5a為例)[13]

Chart 1

稱取4a5.40 g(27.5 mmol)溶解于乙醇(60 mL)中，加入乙醛酸乙酯 6.70 g(33.0 mmol， 50%甲苯溶液)、醋酸2.50 g(41.2 mmol)，升溫至回流，攪拌12 h(HPLC監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完畢后，自然冷卻，有固體析出，過濾，濾餅以乙醇(3×5 mL)洗滌得5a4.30 g，收率 67%；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.84(s, 1H), 8.10(s, 1H), 3.07～2.93(m, 1H), 2.66(s, 3H), 1.40～1.25(m, 2H), 1.09～0.93(m, 2H)； LC-MS(ESI)m/z: 235.1{[M+H]+}。

化合物5b合成類似于5a，但因取代基團(tuán)位阻增大需要在150 ℃進(jìn)行反應(yīng)。

5b： 黃色固體，收率45%；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.87(s, 1H), 8.10(s, 1H), 5.86～5.70(m, 1H), 2.63(s, 3H), 2.39～2.25(m, 2H), 2.16～2.02(m, 2H), 1.98～1.86(m, 2H), 1.78～1.66(m, 2H)； LC-MS(ESI)m/z: 263.1{[M+H]+}。

(5)6a～6b的合成(以6a為例)[14]

稱取5a5.00 g(21.4 mmol)溶解于氯仿(50 mL)中，在-5 ℃冰鹽浴條件下，緩慢加入m-CPBA 4.80 g(23.5 mmol， 85%純度)，攪拌一段時(shí)間后有固體析出(TLC 監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完畢后，加入5%亞硫酸鈉水溶液(50 mL)攪拌0.5 h，加入二氯甲烷(2×100 mL)萃取，二氯甲烷相加入半飽和碳酸鈉水溶液(100 mL)萃取，飽和NaCl水溶液(100 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干，得到橙黃色固體6a4.50 g，收率83%；直接參與下一步反應(yīng)。

(6)7a～7b的合成(以7a為例)[15]

稱取6a4.00 g(16.0 mmol)于無水THF(40 mL)中，加入DIPEA(4.5 mL， 32.0 mmol)、嗎啉2.10 g(24.0 mmol)，攪拌過夜(TLC監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完畢后，加水(400 mL)，過濾，得黃色固體7a3.80 g，收率 88%， m.p.192～195 ℃；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.67(s, 1H), 7.85(s, 1H), 3.95(t,J=4.8 Hz, 4H), 3.79(t,J=4.8 Hz, 4H), 2.97～2.84(m, 1H), 1.34～1.18(m, 2H), 1.06～0.98(m, 2H)；13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 160.02, 159.42, 158.23, 151.77, 145.83, 120.25, 66.84, 44.72, 24.62, 8.69； LC-MS(ESI)m/z: 274.1{[M+H]+}。

7b： 淡粉色固體，收率90%， m.p.145～148 ℃；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.68(s, 1H), 7.84(s, 1H), 5.76～5.60(m, 1H), 3.91(t,J=4.8 Hz, 4H), 3.79(t,J=4.8 Hz, 4H), 2.41～2.25(m, 2H), 2.10～1.95(m, 2H), 1.94～1.80(m, 2H), 1.73～1.62(m, 2H)；13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 159.95, 159.68, 157.34, 150.71, 146.28, 120.48, 66.82, 53.30, 44.81, 27.88, 25.7； LC-MS(ESI)m/z: 302.2{[M+H]+}。

(7)TM1～TM2的合成(以TM1為例[16])

稱取7a1.00 g(3.7 mmol)于乙腈(20 mL) 中，加入NBS 0.70 g(4.3 mmol)，油浴溫度60 ℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌(TLC監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完畢后，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(二氯甲烷)=1/20]純化得淡黃色化合物TM11.00 g，收率78%， m.p.185～188 ℃；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.63(s, 1H), 3.94(t,J=4.8 Hz, 4H), 3.79(t,J=4.8 Hz, 4H), 3.04～2.88(m, 1H), 1.37～1.18(m, 2H), 1.08～0.90(m, 2H)；13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 159.83, 158.67, 154.52, 151.75, 138.07, 119.60, 66.82, 44.79, 26.30, 9.05； LC-MS(ESI)m/z: 352.1{[M+H]+}。

TM2： 黃色固體，收率90%， m.p.215～218 ℃；1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.66(s, 1H), 5.83～5.68(m, 1H), 3.97～3.87(br, 4H), 3.79(t,J=4.8 Hz, 4H), 2.33～2.20(m 2H), 2.13～2.00(m, 2H), 1.95～1.82(m, 2H), 1.73～1.62(m, 2H)；13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 159.75, 158.89, 153.25, 150.68, 138.90, 119.94, 66.78, 54.76, 44.85, 28.03, 25.99； LC-MS(ESI)m/z: 380.2{[M+H]+}。

(8)TM3～TM4的合成(以TM3為例)

稱取TM1500.0 mg(1.4 mmol)、 Pd(dba)330.0 mg(0.03 mmol)、 KOH 160.0 mg(2.8 mmol)和XPhos 20.0 mg(0.04 mmol)加入到5 mL微波管中，再加入二氧六環(huán)(2 mL)與水(2 mL)，130 ℃微波反應(yīng)0.5 h(TLC監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完畢，用5%稀鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至pH至4，加入二氯甲烷(3×20 mL)與水(20 mL)萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離[洗脫劑：V(甲醇)/V(二氯甲烷)=1/30]純化后，再加入少量二氯甲烷(3 mL)，石油醚(20 mL)，減壓濃縮除去二氯甲烷，過濾，得黃色固體TM3100.0 mg，收率25%， m.p.310～313 ℃；1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.73(s, 1H), 8.06(s, 1H), 3.67(s, 8H), 2.84～2.74(m, 1H), 1.17～1.07(m, 2H), 0.82-0.74(m, 2H)；13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 157.71, 157.08, 152.56, 147.34, 143.12, 112.04, 65.90, 44.36, 24.97, 8.53； LC-MS(ESI)m/z: 290.1{[M+H]+}。

TM4： 淡黃色固體，收率24%， m.p.300～304 ℃；1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.80(s, 1H), 8.10(s, 1H), 5.66～5.50(m, 1H), 3.71～3.65(m, 4H), 3.65～3.58(m, 4H), 2.23～2.07(m, 2H), 1.99～1.86(m, 2H), 1.85～1.73(m,2H), 1.67～1.54(m,2H)；13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 156.98, 156.73, 152.34, 146.04, 143.80, 112.13, 65.86, 53.07, 44.37, 27.46, 25.24; LC-MS(ESI)m/z: 318.2{[M+H]+}。

(8)TM5～TM6的合成(以TM5為例[17])

稱取TM1500.0 mg(1.4 mmol)、 4-羥基苯硼酸386.2 mg(2.8 mmol)、 Pd(dppf)Cl230.0 mg(0.04 mmol)和K2CO3393.0 mg(2.8 mmol)加入到無水THF(10 mL)中攪拌均勻，氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫至劇烈回流，攪拌0.5 h后滴加水(2 mL)到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌3 h(TLC監(jiān)測(cè))。反應(yīng)結(jié)束，減壓濃縮，用二氯甲烷(3×30 mL)和水(20 mL)萃取，飽和NaCl水溶液(20 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析分離[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(二氯甲烷)=1/20]純化后，加入少量二氯甲烷(3 mL)，大量石油醚(20 mL)，減壓濃縮除去二氯甲烷，過濾，得黃色固體TM5240.0 mg，收率45%， m.p.213～214 ℃；1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.67(s, 1H), 8.08(ddd,J=2.0 Hz, 2.8 Hz, 9.6 Hz, 2H), 8.83(ddd,J=2.0 Hz, 2.8 Hz, 9.6 Hz, 2H), 3.95(t,J=4.8 Hz, 4H), 3.78(t,J=4.8 Hz, 4H), 2.98～2.90(m, 1H), 1.30～1.26(m, 2H), 1.00～0.93(m, 2H)；13C NMR(101 MHz, CDCl3: DMSO-d6=10 : 1)δ: 159.09, 158.73, 158.01, 157.63, 151.28, 150.00, 130.93, 126.78, 119.72, 114.93, 66.61, 44.59, 24.95, 8.80； LC-MS(ESI)m/z: 366.1{[M+H]+}。

TM6： 黃綠色固體，收率82%， m.p.245～249 ℃；1H NMR(400 MHz, CDCl3/ CD3OD=10/1)δ: 8.66(s, 1H), 8.05～7.95(m, 2H), 6.86～6.74(m, 2H), 5.82～5.64(m, 1H), 3.85(t,J=4.0 Hz, 4H), 3.75(t,J=4.0 Hz, 4H), 2.38～2.21(m, 2H), 2.08～1.92(m, 2H), 1.90～1.76(m, 2H), 1.72～1.56(m, 2H)；13C NMR(101 MHz, CDCl3/CD3OD=10/1)δ: 159.25, 158.87, 158.72, 156.81, 150.52, 150.16, 131.03, 127.25, 120.10, 115.03, 66.73, 53.64, 44.68, 27.76, 25.77； LC-MS(ESI)m/z: 394.2{[M+H]+}。

(9)TM7～TM8的合成(以TM7為例[18])

稱取M1500.0 mg(1.4 mmol)、反式-1,4-環(huán)己二胺265.0 mg(5.6 mmol)和DIPEA(980.0 μL， 5.6 mmol)加入5 mL微波管中，再加入二氧六環(huán)(5 mL)，150 ℃微波反應(yīng)4 h(TLC監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完畢，用5%稀鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至pH至4，加入二氯甲烷(3×20 mL)與水(20 mL)萃取，飽和NaCl水溶液(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析分離[洗脫劑：V(甲醇)/V(二氯甲烷)=1/30]純化后，加入少量二氯甲烷(3 mL)，石油醚(20 mL)，減壓濃縮除去二氯甲烷，過濾，得黃色固體TM7200.0 mg，收率39%， m.p.135～137 ℃；1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.31(s, 1H), 3.87～3.79(m, 1H), 3.76(s, 8H), 2.99～2.87(m, 1H), 2.75～2.62(m, 1H), 2.15～2.02(m, 2H), 1.99～1.89(m, 2H), 1.48～1.26(m, 4H), 1.24～1.16(m, 2H), 0.97～0.89(m, 2H)；13C NMR(101 MHz, CD3OD)δ: 158.77, 156.33, 153.97, 149.82, 184.41, 121.23, 67.78, 50.86, 50.27, 46.03, 35.38, 32.12, 26.04, 9.36； LC-MS(ESI)m/z: 386.2{[M+H]+}。

TM8： 黃色固體，收率58%， m.p.90～94 ℃；1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.39(s, 1H), 5.90～5.75(m, 1H), 3.89～3.80(m, 1H), 3.80～3.69(m, 8H), 2.75～2.64(m, 1H), 2.41～2.25(m, 2H), 2.14～1.98(m, 4H), 1.98～1.82(m, 4H), 1.76～1.63(m, 2H), 1.47～1.24(m, 4H)；13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 157.66, 154.48, 153.89, 147.26, 146.97, 120.40, 66.91, 53.68, 50.22, 48.80, 44.98, 34.19, 31.39, 28.13, 25.86； LC-MS(ESI)m/z: 414.2{[M+H]+}。

1.3 體外抗腫瘤活性測(cè)試

將待測(cè)化合物用DMSO溶解，用對(duì)應(yīng)細(xì)胞所需培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋。稀釋倍數(shù)的選擇先進(jìn)行粗篩，得到IC50值的粗略范圍；按2～3倍梯度稀釋成6個(gè)濃度，使得粗篩結(jié)果落在6個(gè)濃度中間。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞配成3×104～4×104個(gè)mL濃度，每孔100 μL鋪于96孔板中，設(shè)置空白組、對(duì)照組以及給藥組，周圍鋪上100 μL PBS溶液防止邊緣效應(yīng)，置于37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去96孔板中培養(yǎng)基，換為用含有已設(shè)計(jì)藥物濃度的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，避光加入CCK8試劑，避光培養(yǎng)1 h(OD值在1.0附近)。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性

(1)選擇人肝癌細(xì)胞(HepG2)、乳腺癌細(xì)胞(MCF7)、人肺腺癌細(xì)胞(NCI-H1975)和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(HCC827)為測(cè)試細(xì)胞株，以Sorafenib、 Axitinib與Lenvatinib為陽(yáng)性對(duì)照，采用CCK8法[19-20]對(duì)目標(biāo)化合物TM1～TM8進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞活性測(cè)試，結(jié)果以IC50值的形式體現(xiàn)在表1。

由表可知，化合物TM1和TM8對(duì)四種腫瘤均表現(xiàn)出良好的抑制活性；與陽(yáng)性對(duì)照相比，TM1、TM4、TM5、TM6和TM8對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制效果均強(qiáng)于Lenvatinib；TM1、TM2、TM4、TM6和TM8對(duì)MCF7細(xì)胞的抑制作用均強(qiáng)于Axitinib和Lenvatinib；TM1對(duì)MCF7、 H1975和HCC827細(xì)胞抑制效果強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥物Axitinib。

2.2 構(gòu)效關(guān)系

從細(xì)胞生物活性結(jié)果可知，在化合物8-位，體外抗腫瘤活性三元環(huán)大于五元環(huán)，后續(xù)可進(jìn)一步嘗試位阻較小的基團(tuán)，如甲基、異丙基等；6-位進(jìn)行了3種類型的取代：溴原子、芳香環(huán)基團(tuán)和以氮原子為橋梁連接的基團(tuán)，其中溴原子取代的化合物活性最好，芳香環(huán)基團(tuán)取代化合物活性稍強(qiáng)于以氮原子為橋梁連接的基團(tuán)，后續(xù)可以選擇位阻小于芳香環(huán)的基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。

本研究以羰基蝶啶為半剛性結(jié)構(gòu)母核，設(shè)計(jì)合成了8種抗腫瘤化合物(TM1～TM8)，體外活性測(cè)試結(jié)果顯示：TM1對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)、乳腺癌細(xì)胞(MCF7)、人肺腺癌細(xì)胞(NCI-H1975)和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(HCC827)均有良好的抑制作用，IC50值分別為20.96、 12.63、 3.63和6.41 μmol·L-1。在此基礎(chǔ)上提出了該類母核不同取代位點(diǎn)的初步構(gòu)效關(guān)系，為后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供方向與建議。