王從凱，張 鑫綜述，李愛民審校

0 引 言

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是致死率最高的卒中亞型，占急性腦血管病的20%～30%[1]。盡管ICH的病理生理被廣泛研究，但尚無臨床認(rèn)可的神經(jīng)保護(hù)治療方法。目前越來越多證據(jù)表明炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷中的核心部分[2-4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損最終必然引起炎癥免疫反應(yīng)，而多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils, PMNs)最早到達(dá)ICH部位，是發(fā)揮主要作用的外周免疫細(xì)胞[5-6]。一方面通過吞噬血腫降解異物發(fā)揮有益作用，另一方面PMNs到達(dá)出血部位并浸潤腦實(shí)質(zhì)，釋放大量的炎性細(xì)胞因子，激活其他細(xì)胞炎性細(xì)胞，通過破壞血管基質(zhì)，損傷神經(jīng)元及破壞血腦屏障(blood brain barrier，BBB)完整性從而引起繼發(fā)性腦損傷[7]。PMNs新的殺菌機(jī)制-中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抗炎作用亦被廣泛研究[8]。近來研究顯示ICH患者外周PMNs計(jì)數(shù)升高和中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)升高是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同樣表示PMNs在ICH發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色[9]。本文就PMNs在ICH繼發(fā)性損傷中的作用及相關(guān)最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 PMNs與ICH繼發(fā)性損傷

1.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的PMNsPMNs亦可簡稱中性粒細(xì)胞，是人體免疫系統(tǒng)中含量最豐富的白細(xì)胞[10]。PMNs來自骨髓中的粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞。一般需要14 d的生長周期，PMNs成熟，增殖，分化并發(fā)育出其特征性顆粒[11-12]。正常情況下由于存在腦血屏障，極少存在于腦實(shí)質(zhì)和腦脊液中[13]。腦內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接可確保屏障完整性和高選擇性。然而，在感染，創(chuàng)傷，局部缺血和出血等病理狀況下，PMNs進(jìn)入腦組織的數(shù)量增加[14-16]。在被招募的炎癥細(xì)胞中，PMNs被認(rèn)為首先到達(dá)血腫區(qū)域發(fā)揮固有免疫應(yīng)答作用。目前實(shí)驗(yàn)表明，小鼠PMNs的平均壽命可達(dá)12.5 h，而人類PMNs的平均循環(huán)壽命可達(dá)5.4 h[17]。在炎癥反應(yīng)過程中，由于炎性因子或者細(xì)菌產(chǎn)物的作用，PMNs的生存期可相對延長。Zhao等[15]對ICH 大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)PMNs 在ICH后 24～48 h 達(dá)到高峰，3 d時(shí)數(shù)量下降，14 d時(shí)仍可見少量表達(dá)。

PMNs的分化和成熟與其功能緊密相關(guān)。其分化成熟受到內(nèi)源性因素例如粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)或外部刺激(創(chuàng)傷，藥物和輻射等)調(diào)節(jié)。隨著分化和成熟，PMNs膜蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化，對于感知感染信號，遷移到目標(biāo)組織以及吞噬細(xì)胞組織碎片很重要。在成熟和活化的PMNs中，整聯(lián)蛋白β1和趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)被下調(diào)，而CXCR2，Toll樣受體4，甲酰肽受體(N-formyl peptide receptor，F(xiàn)PR)，CD11b和CD35被上調(diào)。除膜受體外，各種顆粒蛋白的表達(dá)水平也發(fā)生重大變化。顆粒蛋白一般分為三種：初級顆粒包括髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)和組織蛋白酶G；次要顆粒包括Lysozyme和乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)；三級顆粒包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)[18-19]。除脫粒和吞噬作用外，積聚的粒細(xì)胞還可釋放由DNA和稱為嗜中性粒細(xì)胞外陷阱的蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其會損害血腦屏障，并造成周圍神經(jīng)元和大腦其他細(xì)胞的后續(xù)傷害[8]。目前NETs在缺血性卒、神經(jīng)退行性病變及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中已被廣泛研究，而對于在ICH中具體的作用目前研究較少仍需進(jìn)一步探索。

1.2PMNs對血腦屏障的破壞血腦屏障是一種由特殊分化的微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足組成緊密連接的高度選擇性生物屏障[20]。ICH時(shí)，血液從破裂的血管進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)及其間隙，導(dǎo)致原發(fā)性腦損傷。除血管破入腦組織的PMNs，PMNs通過聚集、滾動(dòng)、黏附、爬行和遷移至受損區(qū)域，實(shí)驗(yàn)證實(shí)在ICH核心區(qū)域和血腫邊緣發(fā)現(xiàn)了大量的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞(與血管無明顯關(guān)聯(lián))[15]；通過釋放的一系列因子包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、MMP、NE及細(xì)胞因子等破壞BBB，進(jìn)一步加重腦損傷[7,21]。中性粒細(xì)胞來源的MMP在ICH后血腦屏障的損傷中發(fā)揮重要作用，包括MMP-2、MMP-3和MMP-9[22]。MMP在卒中后24 h內(nèi)可被白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)明顯誘導(dǎo)，并使神經(jīng)血管單位的結(jié)構(gòu)發(fā)生退化?；罨腗MP-9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)的層粘連蛋白、膠原酶及緊密連接蛋白參與損害血腦屏障。研究表明，在用抗多形核白細(xì)胞抗體(anti-PMNs)消耗了循環(huán)血液PMNs后，MMP-9產(chǎn)生減少，繼發(fā)性BBB破壞以及軸索損傷均減輕，從而減輕了大鼠ICH后繼發(fā)性腦損傷[14]。NE是極具破壞性的蛋白水解酶，一旦釋放進(jìn)入相關(guān)的受損腦組織，NE 就可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)及其他蛋白成分；從而損傷血管，增加血管通透性，加重血腦屏障損傷，進(jìn)一步造成腦水腫[23]。激活的PMNs也是ROS、一氧化二氮(nitrous oxide，NOS)等自由基的關(guān)鍵來源。ROS通過誘導(dǎo)直接氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞作用于神經(jīng)血管單位，導(dǎo)致BBB通透性增加[24]。顯然，中性粒細(xì)胞對血腦屏障的分解有助于招募更多的免疫細(xì)胞來清除細(xì)胞碎片，但同時(shí)也導(dǎo)致了腦內(nèi)繼發(fā)的損傷。

1.3PMNs加重腦水腫ICH后的腦水腫是ICH后繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素，其引起的顱內(nèi)壓升高和低灌注壓增加了腦疝、腦梗塞發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[25-26]。ICH后腦水腫有三種主要類型[27]：血管源性水腫，細(xì)胞毒性水腫和混合性水腫。血管源性水腫歸因于血腦屏障的破壞，損傷的血腦屏障使血管內(nèi)的蛋白質(zhì)和液體滲入實(shí)質(zhì)細(xì)胞外空間；細(xì)胞毒性水腫是由于腦缺血、缺氧，能量ATP供應(yīng)不足，致使離子泵的功能衰竭，細(xì)胞中異常水潴留的結(jié)果；滲透性水腫是由血液和組織之間的滲透性失衡引起的[28-29]。PMNs和ICH后腦水腫緊密相連，一些研究表明PMNs的耗竭顯著降低了腦組織水腫。由于血管源性水腫與血腦屏障的血管完整性緊密相關(guān)，PMNs與血腦屏障之間的相互作用也可能影響血管源性水腫。PMNs通過和內(nèi)皮細(xì)胞之間的異常相互作用參與了血腦屏障的分解。除受損傷的組織或PMNs釋放的趨化因子、彈性蛋白酶和活性氧以外，其他的各種介質(zhì)諸如谷氨酸，乳酸，H+，K+，Ca2+，組胺和激肽亦可增強(qiáng)血管源性和細(xì)胞毒性水腫，還可促進(jìn)廣泛的PMNs浸潤和神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞損失[30]。細(xì)胞毒性水腫通常伴隨細(xì)胞內(nèi)Na+和其他陽離子的積。Na+/H+離子泵在腦組織細(xì)胞毒性水腫中發(fā)揮重要作用[31-32]。有研究表明，在小鼠實(shí)驗(yàn)中性胞內(nèi)鈉濃度的改變對于活化的PMNs趨化功能有密切影響[33]。O'Donnell等[34]表明用Na+/H+交換抑制劑HOE-642抑制Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可顯著減輕缺血模型中的腦梗死體積，減輕腦水腫和PMNs積累。因此，除傳統(tǒng)的細(xì)胞因子外，受損腦組織中的酸度和陽離子都可調(diào)節(jié)PMNs的活化和細(xì)胞毒性水腫。

1.4PMNs與血腫擴(kuò)大血腫擴(kuò)大(hematoma expansion，HE)一般發(fā)生在初次出血后的6 h內(nèi)，是早期神經(jīng)功能惡化和長期不良功能預(yù)后的有力預(yù)測指標(biāo)[35]。白細(xì)胞與血小板，血管內(nèi)皮和凝血因子相互作用，被認(rèn)為是在生理和病理?xiàng)l件下促進(jìn)止血的重要因素[36]?；罨腜MNs表現(xiàn)出顯著的促凝特性，因此可能在ICH發(fā)生后止血中起重要作用[37]。首先，PMNs釋放組織因子(tissue factor，TF)并下調(diào)TF途徑抑制劑，有利于血栓形成；其次，PMNs可激活血小板，X因子和XII因子，增強(qiáng)凝血酶的生成，并有助于纖維蛋白凝塊的穩(wěn)定[38-39]。PMNs在ICH超急性期的激活可能通過促進(jìn)凝血系統(tǒng)而限制血腫擴(kuò)大。Chen等[40]對2546例ICH患者行回顧性分析，研究結(jié)果顯示入院時(shí)白細(xì)胞，PMNs和單核細(xì)胞的外周計(jì)數(shù)與早期血腫擴(kuò)大的風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)；ICH后白細(xì)胞及PMNs升高降低血腫擴(kuò)大風(fēng)險(xiǎn)，單核細(xì)胞升高增加血腫擴(kuò)大風(fēng)險(xiǎn)。然而PMNs釋放的NE、MPO及組織蛋白酶等可誘導(dǎo)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和損傷血管結(jié)構(gòu)。損傷的小動(dòng)脈可能繼發(fā)出血并形成血腫擴(kuò)大征象。有ICH模型證實(shí)PMNs于ICH后1-3 d在血腫周圍浸潤達(dá)到高峰，但血腫周圍血管結(jié)構(gòu)在 ICH 發(fā)生后逐漸出現(xiàn)進(jìn)行減少[15]。對于PMNs與血腫擴(kuò)大的關(guān)系似乎患者回顧性分析結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果有矛盾之處，表明兩者之間關(guān)系復(fù)雜，需要更加深入探究。

2 PMNs的表型轉(zhuǎn)換和神經(jīng)保護(hù)作用

最近越來越多的證據(jù)表明，與其他免疫細(xì)胞一樣，PMNs可能表現(xiàn)出一定程度的功能可塑性，類似于Th1型/Th2型(T細(xì)胞)、M1/M2(小膠質(zhì)細(xì)胞)[41-43]。N1 PMNs表型是指具有更強(qiáng)的促炎/氧化特性的PMNs，胞內(nèi)主要表達(dá) MPO、NE 等殺傷細(xì)菌及抗原成分，具有有效的抗腫瘤和抗微生物作用，可能對卒中患者的大腦造成更大的有害影響。假設(shè)大多數(shù)循環(huán)中的PMNs通常處于N1狀態(tài)，為最大限度地提高其有效參與抗菌活動(dòng)的能力，卒中后早期進(jìn)入大腦的PMNs可能主要是有害的。相反，N2 PMNs表型的特征是促炎特性降低，胞內(nèi)含有豐富的LF和結(jié)合珠蛋白等對組織修復(fù)有益成分。因此，有學(xué)者提出PNMs對卒中結(jié)局的影響可能取決于N1/N2比率，該比率可能在卒中后隨時(shí)間改變，從而減少PMNs浸潤的有害影響，甚至潛在地賦予受損組織好處。Zhao等[44]表明腦內(nèi)出血后腦脊液和血液中的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-27被上調(diào)；發(fā)現(xiàn)IL-27可改變骨髓中PMNs的成熟，抑制其促炎和細(xì)胞毒性信號的產(chǎn)生，同時(shí)增加其有益的鐵清除分子(如乳鐵蛋白)的產(chǎn)生。重要的是，IL-27或乳鐵蛋白減少了腦水腫，增加了血腫清除率，并改善了ICH后的神經(jīng)功能。這些結(jié)果表明IL-27/乳鐵蛋白介導(dǎo)的嗜PMNs功能調(diào)節(jié)可能代表了免疫治療的目標(biāo)。此外，過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ(pperoxisomeproliferators-activated receptor，PPARγ)激活促進(jìn)了巨噬細(xì)胞Mφ向愈合(M2)表型的轉(zhuǎn)化。Cuartero等[45]最近發(fā)現(xiàn)，患有腦缺血并接受PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮治療的小鼠，顯示N2(Ym1)表型比例增加并且梗死面積減少。近期一項(xiàng)研究確定了PMNs未成熟N2亞型，該N2型PMNs可滲入小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的部位，并部分地通過分泌各種生長因子來促進(jìn)神經(jīng)損傷的保護(hù)和再生。

3 PMNs在卒中預(yù)后預(yù)測中的價(jià)值

PMNs及其相關(guān)的炎癥指標(biāo)逐漸被發(fā)現(xiàn)在卒中預(yù)后預(yù)測中的具有重要價(jià)值。證據(jù)表明外周血白細(xì)胞及PMNs水平對于卒中后神經(jīng)系統(tǒng)惡化和預(yù)后具有預(yù)測價(jià)值。Tao等[46]回顧性納入336例發(fā)病24h內(nèi)的ICH患者，通過多因素分析顯示，較高的PMNs計(jì)數(shù)及NLR與死亡率和不良的預(yù)后獨(dú)立相關(guān)，并且與單純PMNs計(jì)數(shù)相比NLR表現(xiàn)出較高的預(yù)測能力。NLR整合白細(xì)胞的兩種亞型，被認(rèn)為是穩(wěn)定有效的炎癥標(biāo)志物，可綜合反映免疫炎癥狀態(tài)[47]。目前大量研究提及表明，NLR對于ICH后血腫周圍水腫體積增大、神經(jīng)功能惡化和不良預(yù)后都有良好的預(yù)測價(jià)值[9,48-49]。這種預(yù)測作用在調(diào)整其他風(fēng)險(xiǎn)因素(年齡，性別，基線血腫量腦室擴(kuò)大出血，格拉斯哥昏迷量表評分，卒中后發(fā)作的時(shí)間)以后仍然存在。而其他的PMNs相關(guān)炎癥標(biāo)志物，如中性粒細(xì)胞比白蛋白比值(neutrophil-to-albumin ratio，NAR)，目前證明在腫瘤及重癥感染預(yù)后、頸動(dòng)脈狹窄術(shù)再狹窄等方面均有較好的預(yù)測價(jià)值[50-52]；在出血性腦卒中方面，最新研究證明，NAR與動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)患者入院時(shí)神經(jīng)功能分級相關(guān)，并且NAR水平的升高是aSAH患者發(fā)生遲發(fā)性腦缺血的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[53]。因此，中性粒細(xì)胞與白蛋白比值在在ICH預(yù)后中的價(jià)值值得我們進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 語

ICH繼發(fā)性損傷是一個(gè)復(fù)雜的過程，炎性細(xì)胞在此過程中起重要作用。PMNs作為最早被研究的免疫細(xì)胞之一，其詳細(xì)功能仍然不清楚。大量的實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)表明PMNs在腦卒中中具有根本的，主要是有害的作用。PMNs會部分加劇血腦屏障的破壞、腦組織水腫和繼發(fā)性血腫擴(kuò)大，從而影響神經(jīng)功能的預(yù)后。最近的研究還指出了具有神經(jīng)保護(hù)特性的抗炎型N2 PMNs的存在。未來的研究應(yīng)更徹底地表征PMNs的作用，旨在確定PMNs在ICH后炎癥反應(yīng)的治療靶點(diǎn)，選擇性消除PMNs的有害作用，同時(shí)保持其在ICH中的有益作用。但是，針對PMNs的干預(yù)措施應(yīng)謹(jǐn)慎評估，因?yàn)镻MNs的生理功能對于卒中患者的免疫防御至關(guān)重要。