李雨清綜述，張 博，趙瀟雄審校

0 引 言

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，我國某醫(yī)院1年內(nèi)院內(nèi)感染死亡患者占總死亡患者11.5%，死亡患者的院內(nèi)感染率明顯高于其他住院患者，可見院內(nèi)感染是危及住院患者生命的重要因素之一[1]。近年來，由于抗生素的不合理使用，耐藥細(xì)菌感染成為導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要因素[2]。目前常見的多重耐藥性(multidrug resistance，MDR)細(xì)菌有耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus，MRSA)、耐萬古霉素的MRSA、多重耐藥的銅綠假單胞菌、耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、耐萬古霉素的腸球菌、廣泛耐藥的結(jié)核分枝桿菌等[3]，其中院內(nèi)感染最常見的是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌。納米顆粒作為治療劑的應(yīng)用越來越得到重視，其優(yōu)勢主要在于較小的尺寸和較高的表面質(zhì)量比，從而實現(xiàn)與生物系統(tǒng)更有效的相互作用[4]。硒是人體中不可缺少的微量元素，在人體內(nèi)，硒以硒蛋白的形式存在。硒蛋白在抗氧化、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)自身免疫、改善甲狀腺疾病等方面具有重要作用[5-7]。眾多實驗表明，硒納米顆粒(selenium nanoparticles，SeNP)在抗菌方面顯示出良好優(yōu)勢，但SeNP在抗菌方面的作用機(jī)制還不十分明確。本篇綜述介紹了硒納米顆粒的制備方法、抗菌作用、抗菌機(jī)制、生物相容性和臨床應(yīng)用。

1 硒納米顆粒的前期制備及其抗菌作用

硒納米顆粒前期制備的方法多樣，有物理、化學(xué)、生物等多種方式。殊途同歸，這些硒納米顆粒都具有良好的抗菌作用。Geoffrion等[8]學(xué)者使用液體脈沖激光燒濁法(pulsed laser ablation in liquids，PLAL)的物理方法生產(chǎn)純裸SeNP，經(jīng)過兩輪輻照將顆粒尺寸縮小到100 nm以下，這種方法具有尺寸穩(wěn)定、環(huán)保高效、性價比高的優(yōu)點。對所得的硒納米顆粒進(jìn)行抗菌能力測定，實驗發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，SeNP可以降低表皮葡萄球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、銅綠假單胞菌、多重耐藥的大腸埃希菌的存活數(shù)量，且SeNP濃度越高，細(xì)菌存活數(shù)越少[8]。

最近，有學(xué)者提出一種可控納米顆粒尺寸的新型化學(xué)合成法[9]：利用亞硒酸鈉、抗壞血酸和牛血清白蛋白一步反應(yīng)合成牛血清白蛋白包裹的SeNP；產(chǎn)物的直徑大小與攪拌速度、反應(yīng)物與還原劑之比有關(guān)；此法不需使用刺激性溶劑或堿，更加安全環(huán)保。其抗菌效果也令人滿意：在100 r/min，1∶6時，0.1、1 mg/mL的SeNP對金黃色葡萄球菌的抑制率可分別達(dá)到74%、91%[9]。

利用植物、細(xì)菌等生物體合成SeNPs具有取材便捷、環(huán)境友好的優(yōu)勢。由Providencia sp.DCX(一種藻類)合成的SeNP對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制活性，用500 mg/L SeNPs處理時，大多數(shù)測試細(xì)菌會在12 h內(nèi)被破壞，其中革蘭陰性菌的死亡率更高[10]。采用植物乳桿菌LP21合成的SeNP對溶藻弧菌、大腸埃希菌抑菌活性較強(qiáng)，其中，對溶藻弧菌的最低抑菌濃度(MIC)為286 μg/mL[11]。利用革蘭陰性嗜麥芽孢桿菌和革蘭陽性芽孢桿菌合成的SeNP也具有良好的抗菌作用[12]。無論是單獨使用，還是與傳統(tǒng)抗生素結(jié)合使用，SeNP都可以抑制銅綠假單胞菌的生長，或促進(jìn)抗菌劑對銅綠假單胞菌和念珠菌生物膜的滲透[12]。

仿生多功能抗菌納米系統(tǒng)(Ru-Se @ GNP-RBCM)是將Ru復(fù)合體與SeNPs裝入明膠納米顆粒(gelatin nanoparticles，GNPs)中，并在其表面覆上紅細(xì)胞膜(red blood cell membrane，RBCM)構(gòu)建而成的。體外實驗中，由于紅細(xì)胞膜包裹，Ru-Se @ GNP-RBCM可以逃避巨噬細(xì)胞的吞噬作用，提高藥物利用率，有效降低MRSA分泌的外毒素的溶血活性，并釋放Ru-Se NP破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。體內(nèi)感染MRSA的小鼠模型也證明了納米系統(tǒng)具有促進(jìn)細(xì)菌感染傷口愈合的能力[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，對于不同的微生物物種甚至同一物種的不同菌株來說，SeNP的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)差別很大，范圍從4 μg/mL到128 μg/mL不等。其研究結(jié)果大致符合：革蘭陽性菌(如金黃色葡萄球菌)對SeNP較敏感，其MIC比革蘭陰性菌低[14]，但具體原因還有待進(jìn)一步探究。

2 抗菌機(jī)制

2.1 硒納米顆粒抑制生物膜形成生物膜是附著在生物材料表面的微生物群落，在持久的細(xì)菌感染中起重要作用。微生物有兩種不同的生命形式：浮游形式和生物膜形式[15]。當(dāng)人體免疫防御功能下降時，機(jī)會致病性病原體就會在植入物表面黏附、定植，繼而形成生物膜[16]。生物膜可以充當(dāng)機(jī)械屏障，阻礙抗菌劑和免疫反應(yīng)效應(yīng)器的滲透[12]。與浮游形式相比，生物膜形式中的細(xì)菌對于抗生素的抵抗力要高出幾個數(shù)量級[17]。

Tran等[18]分別在體內(nèi)外對SeNP的抗菌性能進(jìn)行了測試。體外實驗表明：SeNP可以抑制MRSA、MRSE的生長，而對原代成骨細(xì)胞的生長無明顯影響。在大鼠體內(nèi)的實驗結(jié)果表明：未涂覆SeNP的植入物周圍組織抽取的菌落總數(shù)高于從涂覆SeNP的植入物周圍的組織中獲取的菌落總數(shù)量(P=0.03)；涂層板上生物膜最大厚度約為3 μm，而未涂層板上的生物膜最大厚度為5～16 μm。SeNP在體內(nèi)外均有良好的抑制MRSA和MRSE生長的作用。

Cihalova等[19]通過測量相對阻抗，來測量細(xì)菌生物膜厚度，阻抗越高，生物膜越厚。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，單獨使用SeNP或抗生素后，金黃色葡萄球菌的相對阻抗值均明顯降低，生物膜破壞率在70%以上；當(dāng)SeNP和抗生素聯(lián)合使用時，生物膜破壞率達(dá)到90%以上。與普通金黃色葡萄球菌相比，MRSA對于SeNP和抗生素的抵抗力更強(qiáng)，SeNP對MRSA生物膜破壞率僅有(55±3)%，抗生素對MRSA生物膜破壞率小于20%；但當(dāng)使用SeNP和抗生素的復(fù)合物時，由于協(xié)同作用，其生物膜破壞率可達(dá)80%。從兩種細(xì)菌的實驗結(jié)果來看，SeNP與抗生素的聯(lián)合使用，可以抑制生物膜的形成。運用質(zhì)譜法對上述各組細(xì)菌進(jìn)行蛋白質(zhì)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在生物膜受抑制的實驗組中，幾乎所有蛋白質(zhì)的表達(dá)均受到抑制，從而推測SeNP和抗生素的聯(lián)合使用抑制了細(xì)菌蛋白質(zhì)的表達(dá)，來影響細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與功能。SeNP可以抑制生物膜形成[20]，使細(xì)菌在組織內(nèi)以浮游形式存在?？股嘏cSeNP的聯(lián)合使用，可以增加細(xì)菌對抗生素的敏感性，以利于抗生素發(fā)揮殺菌作用。

2.2硒納米顆粒下調(diào)細(xì)菌相關(guān)蛋白的表達(dá)外膜蛋白A(OmpA)是革蘭陰性菌外膜蛋白的主要成分，在維持細(xì)菌表面完整性、介導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成、真核細(xì)胞感染、抗生素抗性和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮作用[21]。OmpF孔蛋白通道保護(hù)細(xì)菌免受有害溶質(zhì)滲透，但可以使小的親水性溶質(zhì)穿過細(xì)菌外膜[22]，OmpF孔蛋白的失活可以降低細(xì)菌的黏附、侵襲、定植、增殖能力[23]。大腸埃希菌在涂有SeNP的二氧化鈦納米管中培養(yǎng)24 h后，ompA、ompF基因的表達(dá)下調(diào)，表明暴露于SeNPs的大腸埃希菌可能因為膜功能減弱，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。

Curli是大腸埃希菌外薄而卷曲的蛋白質(zhì)纖維，與生物膜形成、宿主細(xì)胞黏附以及惰性表面定植有關(guān)。Curli的合成受兩個操縱子csgBAC和csgDEFG的控制。csgBAC操縱子編碼curli的結(jié)構(gòu)亞基CsgA和CsgB，以及伴侶蛋白樣蛋白CsgC。csgDEFG操縱子編碼有效轉(zhuǎn)錄，分泌和組裝Curli纖維所需的輔助蛋白[25-26]。CsgA是Curli主要的纖維亞基，CsgG和CsgF是2個外膜定位組件，用于分泌和組裝CsgB和CsgA[27]。在中、低濃度的SeNP會使大腸埃希菌的csgA和csgG基因表達(dá)略有上調(diào)，在高濃度SeNP的樣品上，兩種基因的表達(dá)被進(jìn)一步下調(diào)。表明隨著SeNPs濃度的增加，大腸埃希菌Curli蛋白的表達(dá)受到抑制，從而降低了大腸埃希菌的黏附性[24]。

2.3硒納米顆粒直接破壞細(xì)菌細(xì)胞膜與常規(guī)的微粒相比，納米顆粒的表面積增加，與細(xì)菌之間的相互作用增加；另外，納米顆粒比微米顆粒更有可能進(jìn)入細(xì)胞，從而可能對細(xì)菌產(chǎn)生更強(qiáng)的作用[24]。在一項實驗中，與不添加SeNP的對照組相比，當(dāng)SeNP與細(xì)菌溶液混合時，3 h后，細(xì)菌生長被抑制了約20倍，4 h后被抑制了50倍，5 h后被抑制了60倍[28]。

Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌與SeNP共培養(yǎng)后，泄漏在外的蛋白質(zhì)和多糖明顯增多，這提示細(xì)胞膜通透性改變、細(xì)胞壁遭到破壞；最終，這一推論在掃描電子顯微鏡下得到證實：革蘭陰性菌和枯草芽孢桿菌(G+)大部分細(xì)胞膜被SeNP覆蓋，并且膜表面顯示出明顯凹坑和間隙；金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜起皺、變平、出現(xiàn)漏孔。

MRSA是明膠酶陽性的革蘭陽性菌，大腸埃希菌是明膠酶陰性的革蘭陰性菌。將MRSA、大腸埃希菌分別與Ru-Se @ GNP-RBCM共同培養(yǎng)后，電鏡掃描結(jié)果顯示：MRSA的細(xì)胞壁明顯收縮，破裂嚴(yán)重，細(xì)菌的球形形態(tài)發(fā)生明顯變化，有內(nèi)容漏出；而大腸埃希菌僅有輕微的變形和破裂，其表面黏附有納米顆粒。經(jīng)過其他的實驗對照研究，推測與以下三方面有關(guān)：①MRSA可以分泌明膠酶，降解GNPs，從而釋放Ru-SeNP；②由于MRSA(革蘭陽性菌)沒有脂多糖等結(jié)構(gòu)保護(hù)，納米系統(tǒng)可以對這種相對簡單的細(xì)胞壁造成破壞；③納米系統(tǒng)穿過細(xì)胞壁后，與細(xì)胞膜相互作用，膜結(jié)構(gòu)被大量破壞，從而導(dǎo)致細(xì)菌裂解和內(nèi)容物泄露，造成細(xì)菌死亡[13]。

2.4硒納米顆粒激活釋放細(xì)菌活性氧活性氧是具有高度反應(yīng)性的含氧物質(zhì)[8]，具有直接抗菌作用，可以通過與酶、蛋白質(zhì)、DNA以及細(xì)菌細(xì)胞膜中的硫醇基反應(yīng)等多種途徑來發(fā)揮抗菌作用[29]。加入SeNP的二氧化鈦納米管可以抑制大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的生長[24]。在該體系中，隨著SeNP數(shù)量的增加，細(xì)菌產(chǎn)生活性氧的水平升高，同時抑菌效果也逐漸增強(qiáng)。在電鏡下，可以觀察到細(xì)菌膜上有大量裂紋，細(xì)菌變形塌陷[8]，提示活性氧可能通過膜脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)菌膜孔隙率增加[24]。Cremonini等[14]的實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，加入SeNP后，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌中活性氧水平均明顯上調(diào)。氫過氧化物酶I由大腸埃希菌ahpF基因編碼，可以將活性氧轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇以減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激[30]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)時，ahpF常常會過表達(dá)[31]。與對照組相比，加入不同濃度SeNP后，ahpF基因均被上調(diào)，從側(cè)面印證了細(xì)菌暴露于SeNP環(huán)境中時，活性氧水平的升高[24]。

3 硒納米顆粒的生物相容性

盡管SeNP具有良好的抗菌效應(yīng)，但它仍然具有保護(hù)或促進(jìn)人體正常細(xì)胞的功能，這對于植入物的生物安全性十分重要。與硒和硒酸鹽相比，SeNP具有更好的生物相容性和更低的細(xì)胞毒性[32]。Cremonini等[12]的實驗發(fā)現(xiàn)，在SeNP環(huán)境中，未發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活力喪失、活性氧釋放增加、促炎和免疫刺激性細(xì)胞因子分泌的現(xiàn)象。濃度為1 ppm的SeNP可以明顯抑制銅綠假單胞菌和多重耐藥大腸埃希菌的生長；而在72 h內(nèi)，濃度為1 ppm的SeNP對人皮膚成纖維細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒作用[8]。SeNP對成纖維細(xì)胞應(yīng)激的保護(hù)，與其誘導(dǎo)ATF4和Bcl-xL的表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的衰減有關(guān)[33]。Yazhiniprabha等[34]發(fā)現(xiàn)，利用Murrayakoenigii漿果提取物合成的生物SeNP(Mk-SeNP)，在50 μg/mL的濃度下，對革蘭陰性菌(痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌)和革蘭陽性菌(糞腸球菌、變形鏈球菌)均表現(xiàn)出明顯的抗菌活性；在25 μg/mL的濃度下，可顯著降低上述細(xì)菌的生物膜厚度；但直到100 μg/mL，才顯示出對山羊紅細(xì)胞較低的溶血活性，證明了生物合成的SeNP的生物相容性。

4 硒納米顆粒的臨床應(yīng)用

SeNP在應(yīng)用途徑上多種多樣，可根據(jù)目的和作用靶點進(jìn)行不同設(shè)計。治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等全身性疾病、消化系統(tǒng)疾病可以選擇口服[35]，經(jīng)腸道吸收分布于全身，或經(jīng)過肝代謝處理后達(dá)到治療目的?？谇豢?、骨科為預(yù)防假體植入后的繼發(fā)感染，可將SeNP涂覆在植入物表面[18]，以減少抗生素的使用；同理，也可將其涂覆在導(dǎo)管、插管表面預(yù)防醫(yī)源性感染。SeNP與溶菌酶雜交后負(fù)電荷減少，降低了與細(xì)菌之間的靜電排斥，兩者協(xié)同作用使抗菌作用增強(qiáng)，可在醫(yī)療、生物醫(yī)學(xué)、食品安全中可以得到廣泛應(yīng)用[36]。在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，硒納米顆粒憑借其抗菌作用可用于制作抗菌纖維材料、醫(yī)用敷料及涂層、保健品、醫(yī)用過濾材料等[37]。

5 結(jié) 語

通過一些列體內(nèi)外實驗，SeNP的抗菌作用越來越得到肯定。而對于同一家族的不同菌株來說，SeNP最小抑菌濃度存在差異，這其中的具體原因還有待深入研究。獲取SeNP的途徑多樣，有物理、化學(xué)、生物等多種方式；其中，生物合成取材便捷、環(huán)境友好，逐漸成為研究熱點。金、銀、銅等金屬納米顆粒具有良好的抗菌性能[38]，但一些金屬納米材料會刺激樹突狀細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞釋放活性氧和(或)引起超敏反應(yīng)，給正常組織細(xì)胞帶來損害[12]。例如，納米銀抗菌水凝膠陰道給藥后在短時間內(nèi)會產(chǎn)生一定濃度的蓄積[39]。硒是人類必需的微量元素，而相比于金屬納米顆粒，SeNP具有毒性低、生物相容性高等優(yōu)勢[40]，因此其應(yīng)用前景更加廣闊。由于其良好的抗菌作用，SeNP可以用來治療多種疾病，主要涉及細(xì)菌感染所致疾病，以及預(yù)防假體植入后感染。

對于SeNP抗菌機(jī)制的研究，目前大多停留在可以直接觀測到的細(xì)胞水平，如通過掃描電鏡可以觀察到細(xì)胞膜被破壞、生物膜形成受到抑制，通過熒光標(biāo)記可以觀察到活性氧釋放增多等；而在分子層面，即使通過質(zhì)譜法可以測得蛋白質(zhì)合成受抑制，其具體作用靶點也尚不明了。明確SeNP的抗菌作用機(jī)制及藥理作用，有助于根據(jù)需要設(shè)計不同的藥物劑型治療臨床疾病，因此分子水平上SeNP抗菌機(jī)制的探索，具有重要研究價值。