張?zhí)m心綜述，趙 青審校

0 引 言

隨著不斷進(jìn)化，地球上的大部分生物都形成了以地球自轉(zhuǎn)時(shí)間24 h為周期的細(xì)胞分子、生理活動及行為上的節(jié)律循環(huán)，以使身體內(nèi)部機(jī)能適應(yīng)外部環(huán)境的變化。哺乳動物的中樞震蕩器位于下丘腦視交叉上核，是控制節(jié)律的主鐘，它通過視網(wǎng)膜-下丘腦束接收從視網(wǎng)膜傳入的光信號，再經(jīng)由神經(jīng)、體液信號分子傳遞到外周震蕩器，協(xié)調(diào)整個(gè)生物機(jī)體生物鐘與外界環(huán)境一致。在大部分外周組織中都存在生物鐘的功能，如肝、肺、腎、脾、心臟、骨和軟骨等[1-2]。中樞和外周組織的近日節(jié)律都由近日鐘基因構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，其核心成分包括Bmal1(Brain and muscle Arnt-like 1, Bmal1)、Per(Period, Per)、Clock(Circadian locomotor output cycles kaput, Clock)、Cry(Cryptochrome, Cry)及維甲酸受體相關(guān)孤兒受體Rorα(Retinoid acid receptorrelated orphan receptor α, Rorα)和核受體Rev-erbα；BMAL1和CLOCK構(gòu)成異源二聚體，激活Per，Cry的轉(zhuǎn)錄，而PER和CRY又返回細(xì)胞核抑制BMAL1-CLOCK異二聚體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄活性，由此構(gòu)成一個(gè)24h為周期的負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)[3-4]。生物鐘紊亂與多種節(jié)律失調(diào)的生理性表現(xiàn)如失眠、記憶力減退、心理疾病，代謝性疾病如肥胖、糖尿病，心血管疾病，還有免疫炎癥反應(yīng)，癌癥都有一定關(guān)系[5]。其中Bmal1是正向調(diào)節(jié)近日節(jié)律系統(tǒng)的最關(guān)鍵的成分，是唯一一個(gè)無法替代的基因，敲除會導(dǎo)致近日節(jié)律完全喪失[6]。有研究顯示Bmal1敲除的小鼠不僅失去了行為上的生物節(jié)律，還減少了活動水平，體重喪失，壽命縮短，出現(xiàn)進(jìn)行性的關(guān)節(jié)疾病等表型[7]。

關(guān)節(jié)疾病，在全世界影響最為深遠(yuǎn)的為骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)。OA是一種降解性關(guān)節(jié)疾病，通常累及膝蓋、臀部、手部小關(guān)節(jié)，以及頸椎和腰椎，主要表現(xiàn)為疼痛、運(yùn)動受限，在2020年成為世界第4致殘的疾病，大約有25%骨關(guān)節(jié)炎患者無法進(jìn)行日?；顒?；在65歲以上人群中，有70%～80%至少有一個(gè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)OA的影像學(xué)表現(xiàn)[8-9]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是影響關(guān)節(jié)、結(jié)締組織、肌肉、肌腱和纖維組織的自身免疫性疾病，導(dǎo)致關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞，疼痛和畸形，發(fā)生率約為0.5%～1%，約有50%的RA患者在疾病開始10年內(nèi)逐漸無法進(jìn)行正常工作[8]。關(guān)節(jié)疾病的機(jī)制仍然不清楚，目前認(rèn)為是多因素綜合作用的結(jié)果，年齡、肥胖、機(jī)械損傷、慢性炎癥都是OA的危險(xiǎn)因素，近年來代謝性疾病也發(fā)現(xiàn)與OA有關(guān)；RA與遺傳易感性、環(huán)境因素如飲食習(xí)慣、吸煙有關(guān)[10]。OA的組織病理學(xué)表現(xiàn)主要為軟骨降解，軟骨下骨破壞，軟骨下囊性變化，骨贅形成，滑膜炎，肌腱鈣化或軟骨化生，韌帶退化等；RA主要表現(xiàn)為滑膜增生，也影響骨和軟骨[11]。關(guān)節(jié)疾病嚴(yán)重影響人的生存質(zhì)量，減少社會勞動力，增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)，而目前仍然沒有明顯有效的藥物針對此類疾病。關(guān)節(jié)作為一種受負(fù)器官，受到24h休息與活動節(jié)律的影響，患者癥狀的出現(xiàn)也呈每日規(guī)律性變化[12]。那關(guān)節(jié)是否受到近日節(jié)律基因的調(diào)節(jié)呢，關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)因素是否造成節(jié)律核心基因Bmal1表達(dá)的改變。本文總結(jié)了近年來近日鐘基因核心成分Bmal1與關(guān)節(jié)疾病的聯(lián)系。

1 Bmal1與關(guān)節(jié)軟骨

OA與RA患者的臨床體征和癥狀，如腫脹、疼痛、僵硬和運(yùn)動能力減弱，都遵循著晝夜節(jié)律變化，如RA患者在夜間和清晨疼痛癥狀最明顯，通常稱晨僵，晨僵和功能殘疾密切相關(guān)[13]。而癥狀的變化主要可能是由于炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如IL-17、TNF、IL-6、IL-10和激素水平的晝夜變化影響的，而它們又受到時(shí)鐘基因Bmal1、Per2的調(diào)控[14]。OA患者的血清和尿液生物標(biāo)志物如透明質(zhì)酸、硫酸角蛋白也呈每日節(jié)律變化[15]。RA患者血清中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS3)的產(chǎn)生減少，特別是早上，這與疾病活動性的增加有關(guān)[16]。這表明Bmal1等時(shí)鐘基因可能與關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀的發(fā)生密切相關(guān)。

關(guān)節(jié)骨、軟骨、滑膜中均存在功能性的時(shí)鐘基因，關(guān)節(jié)病主要表現(xiàn)為軟骨的進(jìn)行性退化和破壞。有研究發(fā)現(xiàn)軟骨組織中有619個(gè)基因呈節(jié)律性表達(dá)，包括與軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的關(guān)鍵基因，大部分與生物合成的負(fù)向調(diào)控有關(guān)，且有132個(gè)基因含有Bmal1的結(jié)合位點(diǎn)；Bmal1等鐘基因在OA小鼠模型中軟骨降解的早期階段表達(dá)紊亂[17]。近日鐘基因Bmal1和Nr1d1在體外培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞中呈節(jié)律性表達(dá)，而在人OA膝關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)減少[18]。人關(guān)節(jié)炎和老年小鼠軟骨組織里Bmal1表達(dá)下調(diào)，Bmal1表達(dá)陽性的軟骨細(xì)胞隨炎癥嚴(yán)重程度增加而減少，而敲除軟骨組織中Bmal1的小鼠出現(xiàn)了細(xì)胞外基質(zhì)的降解、關(guān)節(jié)軟骨的明顯退化[19]。人軟骨細(xì)胞中過表達(dá)Bmal1能緩解IL-1?誘導(dǎo)的代謝失調(diào)[20]。證明增齡相關(guān)的軟骨疾病存在Bmal1的失調(diào)，Bmal1是參與調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵鐘基因。有研究發(fā)現(xiàn)OA的致病因子如局部炎癥、氧化應(yīng)激、堿性磷酸鈣晶體沉積減弱了人軟骨細(xì)胞中Bmal1的表達(dá)，而降解軟骨的酶如基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)、含I型血小板反應(yīng)蛋白的解聚素和金屬蛋白酶-5(adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5, ADAMTS5)增加；敲除關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的Bmal1則導(dǎo)致這些酶的表達(dá)進(jìn)一步增加，軟骨細(xì)胞分化減少；恢復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中Bmal1的表達(dá)則減少這些酶的表達(dá)[21]。OA患者軟骨細(xì)胞中Bmal1的峰值表達(dá)比正常軟骨低2.6倍，細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)降解酶的表達(dá)都增加，敲除正常軟骨細(xì)胞中的Bmal1，MMP13的表達(dá)增加6倍[22]。N-甲基D-天冬氨酸受體能通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞鐘基因Bmal1、Per2的表達(dá)，改變軟骨細(xì)胞表型，影響軟骨基質(zhì)的合成與分解[23]。促炎因子IL-1?等通過干擾小鼠軟骨中生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)，促進(jìn)了軟骨的分解代謝[24]。說明這些致病因子可能是通過干擾軟骨細(xì)胞中的時(shí)鐘基因Bmal1來造成軟骨的合成和分解代謝失調(diào)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生。有學(xué)者通過改變光照節(jié)律干擾小鼠的生物節(jié)律促進(jìn)了小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎樣改變，提示經(jīng)常上夜班或者倒時(shí)差的長途旅行者容易發(fā)生生物鐘節(jié)律紊亂，而這的確是OA的一個(gè)危險(xiǎn)因素[25]。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)Bmal1參與調(diào)控關(guān)節(jié)的發(fā)育；Bmal1能通過影響軟骨形成和軟骨內(nèi)礦化調(diào)控小鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突及下頜骨的發(fā)育；時(shí)鐘紊亂動物模型及Bmal1敲除小鼠出現(xiàn)髁突骨量減少、下頜骨發(fā)育不良[26]。敲除軟骨細(xì)胞中的Bmal1減少了生長板中軟骨細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，小鼠出現(xiàn)生長延遲，生長板長度發(fā)育較短等現(xiàn)象；Bmal1能通過HIF1α-VEGF信號通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞的合成代謝功能[27]。已有報(bào)道證實(shí)，Bmal1在軟骨細(xì)胞中還可以通過作用于TGF-?、Hedgehog、NFAT、NFкB、Wnt、MAPK/ERK等下游信號通路來調(diào)控軟骨的合成代謝與分解代謝，進(jìn)而影響關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展[18, 24, 26, 28]。

2 Bmal1與關(guān)節(jié)骨、滑膜、肌腱、韌帶

除了關(guān)節(jié)軟骨以外，Bmal1還會影響軟骨下骨、滑膜、肌腱、韌帶等其他關(guān)節(jié)組織，它們在關(guān)節(jié)行使正常功能過程中發(fā)揮重要作用[29]。血清中的骨代謝標(biāo)志物如鈣、骨鈣素、堿性磷酸酶、甲狀旁腺激素、降鈣素等都呈每日節(jié)律性變化，通過改變明暗環(huán)境擾亂小鼠近日鐘系統(tǒng)后，糖皮質(zhì)激素、骨代謝標(biāo)志物的表達(dá)明顯紊亂[30]。敲除Bmal1后抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力，形成低骨量表型；有研究還發(fā)現(xiàn)敲除小鼠下頜髁突軟骨下骨質(zhì)密度的變化，關(guān)節(jié)周圍組織發(fā)生異位礦化，小鼠體重下降[31-32]?；ぜ?xì)胞中的時(shí)鐘基因Bmal1、Rev-erbα成節(jié)律性表達(dá)，Bmal1有望能抑制RA滑膜腫瘤樣的過度增生[33]。RA滑膜細(xì)胞中有13個(gè)時(shí)鐘基因表達(dá)紊亂，Bmal1定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是最受影響的鐘基因，炎癥因子IL-6、IL-1b的表達(dá)也受到影響[34]。條件性敲除小鼠關(guān)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞中的Bmal1導(dǎo)致小鼠的成纖維樣滑膜細(xì)胞失去節(jié)律，小鼠腳墊腫脹變厚，脊柱和尾巴椎間盤間隙發(fā)生鈣化，骨刺形成，滑膜變厚，肌腱出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀軟骨化生[35]。敲除小鼠骨骼肌中的Bmal1導(dǎo)致肌肉纖維化、骨鈣化增加、關(guān)節(jié)軟骨減少，出現(xiàn)跟腱鈣化和肌無力等表型；隨年齡增長，Bmal1全敲小鼠關(guān)節(jié)周圍韌帶和肌腱鈣化加重，形成進(jìn)行性關(guān)節(jié)病，幾乎所有35周齡的小鼠都形成了關(guān)節(jié)強(qiáng)直[16, 36-37]。有研究通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)與OA高度相關(guān)的通路為“Circadian rhythm”；低強(qiáng)度脈沖超聲有效治療后，改變了生物鐘基因如Bmal1、Per2的表達(dá)[38]。這些研究結(jié)果佐證了近日鐘基因核心成分Bmal1可能參與到全關(guān)節(jié)的病理性變化中；關(guān)節(jié)炎患者軟骨下骨的病理學(xué)表現(xiàn)可能比軟骨出現(xiàn)更早，滑膜分泌的滑液、炎癥因子對關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生發(fā)展有重要影響，肌腱和韌帶能傳遞力、保持關(guān)節(jié)穩(wěn)定，這些重要關(guān)節(jié)組織的生物鐘系統(tǒng)紊亂可能加重或促進(jìn)關(guān)節(jié)疾病的形成，增加其易感性。

3 Bmal1與免疫、代謝、衰老

異常的免疫細(xì)胞浸潤、紊亂的新陳代謝在關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，OA發(fā)生率隨年齡增長而增加，而Bmal1不僅可以調(diào)節(jié)炎癥因子的節(jié)律性表達(dá)，還與免疫系統(tǒng)，新陳代謝，衰老密切相關(guān)。RA在疾病開始時(shí)，各種免疫細(xì)胞遷移到關(guān)節(jié)，并通過釋放免疫介質(zhì)增加免疫細(xì)胞的募集、促進(jìn)關(guān)節(jié)的破壞；有研究發(fā)現(xiàn)RA患者的外周血中免疫細(xì)胞失去正常的晝夜節(jié)律，而建立了新的“炎性”節(jié)律，證實(shí)免疫細(xì)胞的節(jié)律紊亂可能與RA的發(fā)生有關(guān)[13]。動物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎后，脾中Bmal1的表達(dá)降低，敲除Cry的小鼠，免疫細(xì)胞的數(shù)量與比例發(fā)生變化，血清中炎癥因子增加，滑膜細(xì)胞增殖標(biāo)記物WEE-1表達(dá)增加[39]。缺乏Bmal1的細(xì)胞會產(chǎn)生更多的炎癥因子，增強(qiáng)一些自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化癥、自身免疫性腦脊髓炎的嚴(yán)重性，而增強(qiáng)晝夜節(jié)律功能有機(jī)會減輕高炎性反應(yīng)[40]。另外，肥胖是關(guān)節(jié)炎的重要風(fēng)險(xiǎn)因子，不僅會增加關(guān)節(jié)的負(fù)擔(dān)，脂肪因子等促炎細(xì)胞因子促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨退化，OA伴肥胖的患者行手術(shù)治療的可能性更高；而糖尿病與關(guān)節(jié)炎有共同的危險(xiǎn)因子，會增加關(guān)節(jié)病的嚴(yán)重程度[41-42]。血漿中的血糖、胰島素、脂肪因子等都呈節(jié)律性變化。Bmal1敲除與2型糖尿病有關(guān)，會損傷胰腺β細(xì)胞的功能，并削弱葡萄糖刺激的胰島素分泌；敲除Bmal1的小鼠控制飲食也會導(dǎo)致肥胖，血漿中脂聯(lián)素和瘦素水平升高，比正常小鼠更容易發(fā)生代謝紊亂性疾病[43-44]。肥胖重新定義了BMAL1在人類大網(wǎng)膜脂肪前體細(xì)胞中的全基因組占位，從而改變了許多靶基因的轉(zhuǎn)錄，而加強(qiáng)晝夜節(jié)律可以減少肥胖[45]。年齡是OA發(fā)生的危險(xiǎn)因素，這可能與衰老導(dǎo)致系統(tǒng)性的低程度炎癥和氧代謝物的積累有關(guān)[46]。Bmal1等近日鐘基因的表達(dá)隨年齡增加而減弱[19]。Bmal1敲除的小鼠出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，壽命縮短，活動減少，毛發(fā)稀少，器官萎縮，皮下脂肪和肌肉減少，出現(xiàn)白內(nèi)障[47]。這可能與Bmal1調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)衰老的主要原因之一，Bmal1敲除的細(xì)胞對氧化應(yīng)激敏感性增強(qiáng)，更易損傷DNA[48]。據(jù)報(bào)道端?？s短會增加衰老細(xì)胞的數(shù)量、抑制生物鐘功能、誘發(fā)衰老相關(guān)疾病，而BMAL1-CLOCK復(fù)合物可以調(diào)通過節(jié)端粒穩(wěn)態(tài)、維護(hù)其完整性來預(yù)防早衰[49]。因此Bmal1也可能通過調(diào)控免疫炎癥系統(tǒng)、新陳代謝和衰老來影響關(guān)節(jié)衰老和疾病。

4 結(jié)語與展望

近年來，隨著近日節(jié)律系統(tǒng)受到越來越多的關(guān)注，已經(jīng)有大量研究證實(shí)近日節(jié)律基因與骨、軟骨的密切關(guān)系。由于Bmal1對于中樞和外周節(jié)律系統(tǒng)的啟動起著關(guān)鍵作用，所以成為控制節(jié)律的主要靶點(diǎn)。Bmal1能調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，與全關(guān)節(jié)的病理性變化、關(guān)節(jié)的正常發(fā)育緊密相關(guān)，這豐富了我們對關(guān)節(jié)疾病機(jī)制的認(rèn)識。外界致病因素有可能通過擾亂生物節(jié)律、干擾Bmal1的表達(dá)，導(dǎo)致軟骨合成和分解代謝失調(diào)來直接影響關(guān)節(jié)；Bmal1也可能通過調(diào)控免疫炎癥系統(tǒng)、新陳代謝和衰老來間接影響關(guān)節(jié)疾病。對于近日節(jié)律基因Bmal1的靶向調(diào)控或許能成為緩解關(guān)節(jié)癥狀、治療關(guān)節(jié)疾病的新起點(diǎn)。目前已經(jīng)有很多研究開始針對高血壓疾病進(jìn)行時(shí)間生物學(xué)治療，根據(jù)疾病的節(jié)律性表現(xiàn)調(diào)整個(gè)性化用藥時(shí)間，希望可以增加藥物的療效、減輕副作用。另外，通過規(guī)律飲食、睡眠、運(yùn)動、定期熱敷關(guān)節(jié)等改變外部環(huán)境因素的方法來調(diào)節(jié)內(nèi)部生物節(jié)律也待成為節(jié)律紊亂相關(guān)疾病的有效方法。

但值得注意的是，Bmal1的改變可能引起全身節(jié)律紊亂，如何精確調(diào)控關(guān)節(jié)局部的節(jié)律狀態(tài)有待進(jìn)一步深入研究，并且其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制常常導(dǎo)致矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要控制更多的實(shí)驗(yàn)條件保證最終效應(yīng)的準(zhǔn)確性。不同的關(guān)節(jié)及不同的關(guān)節(jié)疾病可能有不同的致病機(jī)制，如顳下頜關(guān)節(jié)與膝關(guān)節(jié)有纖維軟骨與透明軟骨的區(qū)分、負(fù)重能力和運(yùn)動方式的不同，但顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病發(fā)病率高，研究甚少；Bmal1與不同關(guān)節(jié)疾病的作用機(jī)制也缺乏更加深入的探索，未來需要我們更多的努力，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。