吳白芬，尚 李，尚 怡，何芳雁，浦仕彪，周志宏，劉 錄

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省高校中藥飲片工程研究中心，云南 昆明 650500)

對于嬰兒濕疹，局部外用糖皮質(zhì)激素仍然是多個(gè)國際指南的一線治療方案[1]，其強(qiáng)大的抗炎及免疫抑制作用可迅速控制病情，但停藥后易復(fù)發(fā)，且長期使用后存在局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、皮膚變薄、色素沉著，甚至萎縮等不良反應(yīng)，易并發(fā)感染.較成人而言，嬰幼兒皮膚柔嫩，對藥物吸收更強(qiáng)，同時(shí)嬰幼兒濕疹的皮損范圍廣，常需大面積用藥，對藥物的安全性有更高的要求.基于激素、抗組胺藥等常規(guī)治療依從性差、副作用大、復(fù)發(fā)率高的現(xiàn)狀，且臨床上反復(fù)發(fā)作、遷延日久的難治性嬰兒濕疹日漸增多，迫切需要尋找更安全、有效的治療手段.中醫(yī)藥在嬰兒濕疹治療方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，其外治法更顯示獨(dú)特優(yōu)勢.本研究采用小鼠急性毒性、日本大耳白兔皮膚刺激性和豚鼠皮膚過敏性試驗(yàn)，對4種臨床外用于嬰幼兒濕疹的驗(yàn)方進(jìn)行安全性評價(jià)，以期為進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供安全性依據(jù).

1 試驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，5～6周齡，體重18～21 g，雌雄各半，生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2015-030S.普通級豚鼠，體重220～400 g，雌雄各半；普通級日本大耳白兔，體重2.8～3.5 kg，雌雄各半，生產(chǎn)許可證：SCXK(滇)K 2018-0001.動(dòng)物使用許可證：SYXK(滇)2018-0005.

1.2 受試樣品

方劑1(1#)，由顯齒蛇葡萄、桑白皮及三七等組成；方劑2(2#)，由顯齒蛇葡萄、桑白皮及全蝎等組成；方劑3(3#)，由白鮮皮、紫草及全蝎等組成；方劑4(4#)，由顯齒蛇葡萄、白鮮皮、紫草、桑白皮、三七及全蝎等組成.取各處方藥材，分別加水煎煮3次，合并濾液濃縮至含生藥濃度依次為0.84、0.80、0.80、1.04 g/mL(因?yàn)闈饪s成浸膏也要配制成液體供灌胃用，這樣做的話即可節(jié)能又能節(jié)省時(shí)間.)，4～8 ℃ 冷藏備用.兒膚康搽劑，成都森科制藥有限公司(170807))；2,4-二硝基氟苯(DNFB)，中國上海試劑一廠(2003-07-01).

1.3 統(tǒng)計(jì)軟件

采用SPSS17軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析法；方差齊采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane′s法檢驗(yàn).

2 方法

2.1 急性毒性試驗(yàn)[2]

為提高體內(nèi)暴露水平，特采用口服途徑的最大耐受量試驗(yàn)考察系列方劑的急性毒性.試驗(yàn)時(shí)，選取禁食不禁水 8 h 后體重為18～21 g 小鼠120只，雌雄各半，按性別和體重隨機(jī)分為6組，每組雌雄各10只，見表5.各組動(dòng)物分別按 40 mL/kg(小鼠最大灌胃給藥體積就是 40 mL/kg)容積灌胃給予純水、兒膚康搽劑及各方劑樣品原液(原液含生藥濃度為 1.04 g/mL)，間隔 6 h 后再按同等劑量灌胃給藥1次.觀察各組動(dòng)物給藥后的急性毒性反應(yīng)，主要毒性觀測終點(diǎn)包括：死亡/瀕死觀察、臨床觀察和體重，并對所有存活動(dòng)物于觀察期末(15 d)進(jìn)行解剖，肉眼檢查各組織和臟器的體積、顏色、質(zhì)地等有無異常，如有異常應(yīng)及時(shí)取材進(jìn)行組織病理學(xué)檢查.

2.2 皮膚過敏性試驗(yàn)[3]

選245～400 g 普通級豚鼠60只，按性別和體重分為6組：陰性對照組(純水)、陽性對照組(DNFB，1%為致敏濃度，0.1%為激發(fā)濃度)和各方劑樣品原液組，每組10只，雌雄各半.每次致敏前 24 h 給各只豚鼠背部脫毛 3 cm×3 cm，并保持脫毛區(qū)皮膚完整.在試驗(yàn)第0、7、14天，將純水、1% DNFB及各方劑樣品原液分別涂抹于各組動(dòng)物的脫毛區(qū)皮膚，給藥量均為 0.2 mL/只，并用濾紙、保鮮膜、薄紗布覆蓋固定，以保證藥物與皮膚接觸 6 h 后，溫水沖洗去除剩余藥物.試驗(yàn)第 28 d(末次給藥后 14 d)，再次同法分別涂抹各種藥物于豚鼠脫毛區(qū)皮膚進(jìn)行激發(fā)，觀察給藥后6、24、48、72 h 的皮膚過敏反應(yīng)情況，并按表1評分、按表2計(jì)算發(fā)生率.

表1 皮膚過敏反應(yīng)程度的評分標(biāo)準(zhǔn)[3]

表2 皮膚致敏性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

表3 皮膚刺激性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

表4 皮膚刺激強(qiáng)度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.3 皮膚刺激性試驗(yàn)[3]

采用同體自身對比法，將2.77～3.43 kg 日本大耳白兔8只分為完整皮膚及破損皮膚組，每組4只，雌雄各半.試驗(yàn)前對日本大耳白兔背部去毛，范圍各 20 cm×15 cm.將完整皮膚組和破損皮膚組的背部皮膚均分為5塊：上、左中、右中、左下、右下.破損皮膚組用滅菌手術(shù)刀片在5塊皮膚上各劃一個(gè)“井”字形創(chuàng)口，范圍 2 cm×2 cm，以輕度滲血為度.

各組均取 0.5 mL 純水涂于去毛區(qū)上部；1#樣品原液 0.5 mL 涂于去毛區(qū)左中部；2#樣品原液 0.5 mL 涂于去毛區(qū)右中部；3#樣品原液 0.5 mL 涂于去毛區(qū)左下部;4#樣品原液 0.5 mL 涂于去毛區(qū)右下部.涂藥后以紗布覆蓋，用無刺激性膠布加以固定，分籠飼養(yǎng)，保持藥物貼敷時(shí)間 4 h 后，用溫水清潔給藥部位.連續(xù) 7 d 重復(fù)以上操作，視情況對給藥部位進(jìn)行重復(fù)脫毛.每次給藥前及去除藥物后 1 h，以及末次貼敷去除藥物后1、24、48、72 h，觀察并記錄涂敷部位皮膚有無紅斑和水腫等情況；按表3評分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算每一觀察時(shí)間點(diǎn)各組積分均值及觀察期內(nèi)每天每只動(dòng)物刺激積分均值，并按表4進(jìn)行刺激強(qiáng)度評價(jià).觀察結(jié)束后頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，取給藥部位皮膚進(jìn)行組織病理學(xué)檢查.

3 結(jié)果

3.1 急性毒性

由表5可見，每日選用10只不同性別小鼠，小鼠一日內(nèi)以 40 mL/kg 的最大容積間隔 6 h、2次灌服兒膚康搽劑及各方劑樣品原液，各組動(dòng)物在給藥后 4 h 均有藥樣糞便排泄，疑似腹瀉，其中兒膚康組于給藥次日死亡雄性動(dòng)物1只，其余各組均無明顯毒性反應(yīng)和死亡.在連續(xù) 14 d 的觀察期內(nèi)，各組小鼠體重持續(xù)增長，除兒膚康搽劑組及1#、2#、3#、4#樣品原液雄性動(dòng)物于給藥后1、3 d 的體重增長明顯低于對照組外，其余各組在各時(shí)間點(diǎn)的體重增長與對照組相比無明顯差異.對觀察期結(jié)束處死動(dòng)物的尸檢亦未發(fā)現(xiàn)組織或臟器有明顯異常.研究結(jié)果表明，4種方劑樣品原液的最大耐受量為 80 mL/kg(小鼠 1 d 內(nèi)以 40 mL/kg 的最大容積間隔 6 h、2次)，口服均無急性毒性.

表5 小鼠灌胃途徑最大耐受量試驗(yàn)體重變化

3.2 皮膚過敏性

3.2.1 試驗(yàn)期間純水對照、陽性對照和4種方劑樣品

原液組動(dòng)物進(jìn)食、行為活動(dòng)及精神狀態(tài)良好；各組動(dòng)物體重均有增長，除陽性對照組后期體重增長有緩慢趨勢外，其余各給藥組與陰性對照組相比無顯著差異，每組均選用10只豚鼠，詳見表6.

表6 豚鼠皮膚過敏試驗(yàn)體重變化

3.2.2 致敏評價(jià)

空白性對照及各方劑樣品原液給藥組在激發(fā)后6、24、48、72 h 的觀察點(diǎn)均未見皮膚紅斑和水腫發(fā)生，致敏率為0；陽性對照組所有動(dòng)物在相應(yīng)觀察點(diǎn)均有不同程度的皮膚水腫或紅斑出現(xiàn)，致敏率為100%.4種方劑樣品原液與豚鼠皮膚接觸無致敏性，詳見表7.

表7 豚鼠皮膚過敏試驗(yàn)評分結(jié)果

3.3 皮膚刺激性

3.3.1 一般狀況

4種方劑樣品原液和純水對照連續(xù) 7 d 涂皮給藥，完整皮膚和破損皮膚給藥組日本大耳白兔體重均有增加，2組日本大耳白兔處死前的體重及給藥前體重比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每組選用4只白兔,詳見表8.

表8 對日本大耳白兔體重的影響

3.3.2 肉眼觀察

日本大耳白兔完整皮膚刺激性試驗(yàn)評分結(jié)果顯示各動(dòng)物各受試時(shí)間節(jié)點(diǎn)的在各受試部位刺激性評分均為0，再據(jù)表9可見，4種方劑樣原液連續(xù) 7 d 涂皮給藥，完整皮膚組各給藥部位均未見明顯紅斑和水腫；各樣品對破損皮膚組給藥部位均有少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)輕微的紅斑或水腫，但反應(yīng)平均分值均低于0.49；按表4“皮膚刺激強(qiáng)度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)”，4種方劑樣品原液與皮膚接觸給藥對破損皮膚和完整皮膚均無刺激性.

表9 日本大耳白兔破損皮膚刺激性試驗(yàn)評分表

續(xù)表9

3.3.3 組織病理學(xué)觀察

各方劑樣品原液和純水對照的日本大耳白兔破損皮膚和完整皮膚均可見表皮輕度增厚，真皮乳頭層中多量以淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主的間質(zhì)浸潤.各給藥部位與純水部位相比，組織學(xué)改變的發(fā)生率及程度基本相當(dāng).破損皮膚組結(jié)果見表10和圖1.如圖1所示，圖像采集使用10倍物鏡時(shí)，純水(a)和2#(c)、3#(d)、4#(e)樣品中皮膚真皮乳頭層可見少量淋巴細(xì)胞浸潤；1#(b)樣品真皮乳頭層偶見淋巴細(xì)胞浸潤.完整皮膚組結(jié)果見表11和圖2.如圖2所示，在10倍物鏡下，純水(a),1#(b),2#(c),4#(e)樣品皮膚真皮乳頭層偶見淋巴細(xì)胞浸潤，3#(d)樣品皮膚局部表皮表皮角化不全，真皮乳頭層少量以淋巴細(xì)胞為主浸潤，表明4種方劑樣品原液與皮膚接觸給藥對破損皮膚和完整皮膚均無刺激性.

表10 主要病理改變匯總表(破損皮膚組)

圖1 破損皮膚組

表11 主要病理改變匯總表(完整皮膚組)

圖2 完整皮膚組

4 討論與小結(jié)

中醫(yī)藥在治療嬰兒濕疹方面積累了豐富而又獨(dú)到的經(jīng)驗(yàn).中醫(yī)將嬰兒濕疹歸屬于“奶癬”“胎斂瘡”的范疇，認(rèn)為嬰兒濕疹系因稟賦不耐，脾胃運(yùn)化失職，內(nèi)有胎火濕熱，外受風(fēng)濕熱邪而致[4].治療上應(yīng)清熱解毒、健脾利濕、祛風(fēng)止癢，其方法可分為中藥內(nèi)服法、皮膚外治法、哺乳期母子同治法、中藥灌腸法等.由于嬰兒服藥不便，外治法更顯示獨(dú)特優(yōu)勢.嬰兒皮膚角質(zhì)層薄，有利于藥物吸收，而濕疹病位表淺、病灶外露，外治藥物不僅可以直達(dá)病所，通過透達(dá)腠理、疏暢經(jīng)脈、調(diào)和氣血、驅(qū)邪扶正等機(jī)制而發(fā)揮局部直接的治療作用，還能通過肌腠毛竅，深入臟腑，起到內(nèi)外合治的作用[5].

1#方由顯齒蛇葡萄、桑白皮和三七三味藥材組成；2#方由顯齒蛇葡萄、桑白皮和全蝎三味藥材組成.其中1#、2#方中顯齒蛇葡萄均作為方中君藥，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效，民間外用治療腳丫濕疹及臨床治療小兒濕疹及化膿性皮膚病療效確切[6-8]；臣藥均為桑白皮取其利水消腫的功效[9]，1#方佐以三七活血化瘀、消腫止痛[10-12].1#方諸藥合用，可達(dá)到清熱燥濕、解毒斂瘡的效果，具有消炎、抗菌、抗過敏作用，對滲出性皮膚病有收斂、消炎、止癢之功效；2#方佐以全蝎通絡(luò)搜風(fēng)[13-14].2#方諸藥合用，起清熱解毒、消腫祛濕之功.

3#方由白鮮皮、紫草、全蝎三味藥材組成.白鮮皮作為方中君藥，具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒的功效，是中醫(yī)皮膚科治療皮膚瘙癢特效藥，多用于濕熱證如濕疹、風(fēng)疹、瘡毒、黃水淋漓等[15-17]；臣藥紫草善治各種皮膚疾病，方中取其涼血活血、清熱解毒之功[18-20]；佐以全蝎加強(qiáng)通絡(luò)搜風(fēng)、攻毒解毒之功[13-14].諸藥合用，共奏清熱燥濕、止癢祛風(fēng)之功.4#方由顯齒蛇葡萄、白鮮皮、紫草、桑白皮、三七、全蝎六味藥材組成.諸藥合用，共奏清熱燥濕、活血解毒及祛風(fēng)止癢的功效.

盡管糖皮質(zhì)激素對嬰幼兒濕疹短期療效肯定，但不能根治及停藥后可引起皮損加重或激素依賴性皮炎，尤其是大范圍大劑量用藥還會(huì)導(dǎo)致垂體-下丘腦-腎上腺軸抑制或兒童生長發(fā)育遲緩的嚴(yán)重不良反應(yīng)[21].多數(shù)家長因擔(dān)心“激素藥物毒副作用”而選擇形形色色的“祖?zhèn)髅胤健?、“民間驗(yàn)方”或者醫(yī)療機(jī)構(gòu)方劑，但這類藥物大多沒有經(jīng)過系統(tǒng)的安全性評價(jià)，給嬰幼兒安全用藥帶來潛在風(fēng)險(xiǎn).本研究對4種嬰幼兒濕疹外用方劑進(jìn)行安全性評價(jià)，結(jié)果表明：各方劑樣品經(jīng)小鼠按最大給藥量灌胃未見明顯急性毒性；經(jīng)豚鼠皮膚給藥未見過敏反應(yīng)；對日本大耳白兔連續(xù) 7 d 涂皮給藥無刺激性.本研究表明4種方劑外用給藥均具有較高的安全性，結(jié)合深入的藥物有效性研究，有望發(fā)掘出更好的嬰幼兒濕疹外用制劑.