賴 奇，馬燕華，樊保敏，趙 玲，林成源

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500；2.香港浸會大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，香港 999077)

Spexin(SPX)是通過現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)并鑒定的神經(jīng)肽[1]，屬于甘丙肽(galanin) 家族，可有效激活甘丙肽受體2(GALR2)和甘丙肽受體3(GALR3)[2].病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，spexin 作為一種內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，與肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝、以及抑郁和焦慮相關(guān)疾病的發(fā)病機理密切相關(guān)[3-5].通過對spexin 生理功能和調(diào)節(jié)機制的深入研究可為針對相關(guān)疾病的藥物開發(fā)提供新的科學(xué)證據(jù).

近期研究表明，spexin 及其受體在調(diào)節(jié)動物攝食和胃腸道功能方面發(fā)揮重要的生理學(xué)功能[1, 6].小鼠饑餓狀態(tài)下spexin 表達量顯示規(guī)律性變化，且能夠參與調(diào)節(jié)小腸和結(jié)腸的運動[7].小鼠血液及消化道組織樣本代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，spexin 在脂類代謝通路中發(fā)揮重要作用，可通過調(diào)節(jié)肝臟中膽汁酸的合成影響膽汁酸的肝腸循環(huán)途徑[8].腸道脂質(zhì)代謝的正常運作對于確保向人體各個器官提供充足的能量(以脂質(zhì)形式)非常重要.人體脂質(zhì)吸收過程異?？赡軐?dǎo)致色素性視網(wǎng)膜炎，脊髓小腦變性，生長遲緩等[9-10].此外，腸道中脂類代謝產(chǎn)物的變化顯著影響腸道運動，與便秘或者腹瀉癥狀的發(fā)病過程密切相關(guān)[11-12].

眾所周知，早年的壓力和逆境是人類晚年胃腸道疾病發(fā)作和嚴(yán)重程度的主要危險因素[13].應(yīng)激壓力會引起胃腸道炎癥以及運動失調(diào)從而導(dǎo)致便秘或者腹瀉的產(chǎn)生.前期研究發(fā)現(xiàn)，并且通過腦注射spexin 可有效緩解小鼠焦慮的癥狀，表明spexin 是機體內(nèi)重要的精神調(diào)節(jié)因子[14].然而，應(yīng)激狀態(tài)下spexin 在腸道中的表達狀況尚需進一步研究.綜合現(xiàn)有研究結(jié)果來看，應(yīng)激所導(dǎo)致的腸道運動功能紊亂很有可能與腸道中spexin 的表達及脂代謝的變化水平有關(guān).因此，我們通過對應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠模型結(jié)腸中spexin 及其受體的基因檢測和結(jié)腸組織代謝組學(xué)研究深入探索這一推論的可能性，以期發(fā)現(xiàn)spexin 在焦慮或抑郁等精神疾病所導(dǎo)致的消化道功能紊亂中的作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RNAiso Plus、PrimeScript. RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR. Premix Ex Taq. Ⅱ 購買于TaKaRa 公司(Tokyo，日本)；PCR 引物由上海生物工程有限公司合成；代謝組學(xué)所用化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich 公司(美國).大鼠飼養(yǎng)所需普通飼料和玉米芯墊料均購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所.

1.2 儀器

超高性能液相色譜系統(tǒng)(UHPLC，Agilent 1290 Infinity，美國)；四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(QTOF-MS，Agilent 6543，美國)；組織勻漿儀TissueLyser(Qiagen，德國)；ViiA.7 實時PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)；Eppendrof 5424R 低溫高速離心機(德國).

1.3 應(yīng)激動物模型的建立

SD大鼠購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所.所有動物實驗操作均依據(jù)《云南省實驗動物管理條例》進行，并經(jīng)云南民族大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，許可證編號SYXK(滇)K2017-0001 .

大鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房，溫度控制在21～23 ℃，濕度 50%～65%，光照控制 12 h 明/12 h 暗，所喂飼料、水及所用墊料、籠盒均經(jīng)過嚴(yán)格高壓滅菌，大鼠可自由采食和飲水，除在哺乳期的母鼠，每一籠內(nèi)小鼠不超過4 只，墊料每周更換一次.

懷孕SD 雌性大鼠單獨飼養(yǎng)于SPF 級獨立通氣籠.大鼠分娩后立即將新生幼鼠隨機分配到不同試驗組.母嬰分離模型(NMS)大鼠在出生后2～14 d ，每天與母鼠分開 3 h，而對照組幼鼠則保持與母鼠同籠狀態(tài).斷奶PD 22 d 后將所有雌性大鼠排除在外僅保留雄性鼠進行進一步試驗.大鼠成年后(PD 56)，一半未處理的大鼠每天從PD 57 ～63 暴露于避水應(yīng)激(WAS )狀態(tài)持續(xù) 1 h[15].其余未處理的大鼠分配為對照組.試驗共分為4 組，每組8 只.1)對照組NH+SS；2)母嬰分離組NMS+SS；3)避水應(yīng)激組NH+WAS；4)雙重應(yīng)激組NMS+WAS .觀察實驗期間1 h內(nèi)大鼠的排便顆粒數(shù)，并收集樣品(遠(yuǎn)端結(jié)腸和近端結(jié)腸).將所有樣品立即保存在 -80 ℃ 直至下一步分析.

1.4 實時熒光定量PCR 檢測

使用組織勻漿儀TissueLyzer 將重量為50 mg 的大鼠近端或遠(yuǎn)端結(jié)腸組織樣品勻漿，通過RNAiso Plus 試劑提取總RNA.互補DNA 通過PrimeScript. RT 試劑盒合成.使用SYBR. Premix Ex Taq. Ⅱ在ViiA.7 實時PCR 系統(tǒng)上進行定量實時熒光定量PCR 檢測spexin 以及GALR2 受體的表達情況.將β肌動蛋白基因作為內(nèi)標(biāo)，并使用ΔΔCT 分析方法進一步分析[16].

1.5 UPLC 分離親水性和親脂性代謝組

參照液-液萃取法使用水、甲醇和氯仿的混合物(體積比，1∶2、5∶1)提取結(jié)腸組織樣品[17].渦旋并離心后，將所得上清液與 10 μL 作為內(nèi)標(biāo)(IS)的L-4-氯苯丙氨酸溶液(0.2 mg/mL)混合進行代謝組學(xué)分析.使用超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC，Agilent 1290 Infinity， 美國)分別用親水和親脂色譜柱分離內(nèi)源性極性和非極性代謝組.流動相由含0.1%甲酸的水(A)和含0.1%甲酸的乙腈(B)組成.使用 1.7 μm BEH Amide 色譜柱(2.1 mm×100 mm， Waters，美國)分離親水性代謝組.梯度程序在 12 min 內(nèi)從90%B 開始至30%B，將30% B 保持 1 min，然后在 0.1 min 內(nèi)恢復(fù)到起始條件，重新平衡直至 18 min.流速為 0.25 mL/min，恒溫 40 ℃.使用 1.7 μm C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，Waters，美國)快速分離親脂性代謝物.梯度程序如下：從30%B 開始，在 6 min 內(nèi)升至100%B，在100%B 下保持 2 min，然后在 2 min 內(nèi)回到30%B.隨后將分離出的組分使用質(zhì)譜儀進行分析.

1.6 QTOF-MS 分析和代謝物鑒定

四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(QTOF-MS，Agilent 6543，美國)與電噴霧電離源結(jié)合用于離子碎片收集.全掃描MS 分析，QTOF-MS 條件設(shè)置如下：脫溶劑氣體的溫度為 300 ℃；氣體流量為8 L/min.對于ESI+，毛細(xì)管電壓和錐電壓分別設(shè)置為 3.2 kV 和 35 V；對于ESI-，毛細(xì)管電壓和錐電壓分別設(shè)置為 3 kV 和 50 V.質(zhì)量檢測范圍設(shè)定為80至 1 000m/z.掃描時間設(shè)置為 0.3 s，幀間掃描延遲設(shè)置為 0.02 s.在目標(biāo)MS/MS 采集模式下，將MS/MS 范圍設(shè)置為30至 800m/z，并將碰撞能量設(shè)置為10、20和 40 eV，以便與化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品或METLIN 數(shù)據(jù)庫進行比對.其他參數(shù)與全掃描模式下的設(shè)置相同.

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

使用MassHunter 定性分析程序(B.06 版，Agilent )和XCMS 軟件包對獲取的數(shù)據(jù)進行處理[18].使用SIMCA-P(11.0 版，Umetrics，Umea，瑞典)分析包含任意分配的峰指數(shù)(保留時間-m/z對)，樣品名稱(觀察值)和離子強度信息(變量)的矩陣.進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)來可視化與反應(yīng)表型相關(guān)的特征性代謝譜.PLS-DA 和R分析[19]分別得出的重要特征是VIP> 1，調(diào)整后的p值<0.1 為顯著差異(調(diào)整后的p值采用Benjamini 和Hochberg FDR 計算法).將識別出的特征基于MetaboAnalyst 3.0(http://www. metaboanalyst.ca )上的代謝物組富集分析(MSEA )的富集途徑分析.其他值采用平均值±SEM 表示.使用GraphPad Prism 5.0 軟件(GraphPad Software Inc.) 進行計算和繪圖.使用Student′s t -test統(tǒng)計各組基因表達的差異.顯著性差異用星號表示(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)

2 結(jié)果

2.1 母嬰分離(NMS)和避水應(yīng)激(WAS )顯著增加大鼠排便顆粒數(shù)

正常狀態(tài)下(NH+SS)，觀測到的成年大鼠 1 h 內(nèi)平均排便顆粒數(shù)為1.3～2.5 之間.分別在母嬰分離應(yīng)激(或?qū)φ战M)大鼠出生后第57、58、59、60、61、62 和 63 d 觀測成年雄性大鼠在避水應(yīng)激(或?qū)φ諣顟B(tài)下)1 h內(nèi)糞便排除顆粒數(shù).采用T檢驗與NH+SS組比較對數(shù)據(jù)進行分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001單獨的母嬰分離(NMS)應(yīng)激組大鼠，在第 57 d 和第 63 d 發(fā)現(xiàn)排便顆粒數(shù)有增加趨勢但統(tǒng)計不顯著.在避水應(yīng)激(WAS )刺激下，大鼠 1 h 內(nèi)排便顆粒數(shù)顯著增加，而NMS 和WAS 雙重應(yīng)激對大鼠的排便顆粒數(shù)有疊加效應(yīng)(圖1).說明應(yīng)激狀態(tài)下大鼠的結(jié)腸運動顯著增強.

圖1 大鼠排便顆粒數(shù)統(tǒng)計

2.2 應(yīng)激顯著增加大鼠結(jié)腸中spexin的基因表達

為了更加準(zhǔn)確的反映應(yīng)激誘導(dǎo)的spexin 基因表達的變化，分別對近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸組織樣本進行了分析.結(jié)果顯示，大鼠近端結(jié)腸中spexin 的表達水平在NMS、WAS 以及雙重應(yīng)激狀態(tài)下均顯著增加，且在雙重應(yīng)激組有疊加效應(yīng)(圖2A).將大鼠隨機分為：對照組NH+SS、母嬰分離組NMS+SS、避水應(yīng)激組NH+WAS、雙重應(yīng)激組NMS+WAS.分別取近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸檢測其spexin表達水平.采用T檢驗與NH+SS組比較對數(shù)據(jù)進行分析，*p<0.05盡管遠(yuǎn)端結(jié)腸中亦觀察到spexin 表達的增加，其增加倍數(shù)要小于近端結(jié)腸部位.同時，NMS 和WAS 對遠(yuǎn)端結(jié)腸spexin 的表達影響未表現(xiàn)出疊加效應(yīng)(圖2B).

圖2 應(yīng)激反應(yīng)對結(jié)腸組織中spexin 表達的影響

2.3 應(yīng)激顯著增加大鼠結(jié)腸中GALR2 的基因表達

前期研究發(fā)現(xiàn)，spexin 通過激活GALR2 受體促進腸道運動[7].因此也對應(yīng)激狀態(tài)下GALR2 的表達水平進行了檢測.將大鼠隨機分為：對照組NH+SS、母嬰分離組NMS+SS、避水應(yīng)激組NH+WAS、雙重應(yīng)激組NMS+WAS .分別取近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸檢測其GALR2表達水平.采用T檢驗與NH+SS組比較對數(shù)據(jù)進行分析，*p<0.05.結(jié)果顯示，大鼠近端結(jié)腸中GALR2 的表達水平在NMS、WAS 以及雙重應(yīng)激狀態(tài)下均顯著增加，在雙重應(yīng)激組未呈現(xiàn)出疊加效應(yīng)(圖3A).各組間遠(yuǎn)端結(jié)腸中GALR2 的表達水平差異不顯著(圖3B).

圖3 應(yīng)激反應(yīng)對結(jié)腸組織中GALR2 表達的影響

2.4 應(yīng)激狀態(tài)下大鼠結(jié)腸中代謝組學(xué)的變化

在全局代謝圖譜中，在正離子和負(fù)離子模式下分別捕獲了總共459 個和413 個特征.代表性地，從PLS-DA 模型繪制的三維評分圖顯示對照組、避水應(yīng)激組和母嬰分離組的結(jié)腸組織代謝組明顯分離(圖4).Control：對照組(n=10)；WWAS：避水應(yīng)激組(n=9)；NNMS：母嬰分離組(n=9)其中41 個代謝物在應(yīng)激反應(yīng)時出現(xiàn)了顯著差異，而在避水應(yīng)激組和母嬰分離組大鼠結(jié)腸組織中同時出現(xiàn)變化的代謝物有16 個(表1).

圖4 通過PLS-DAA 模型的前3個主要成分計算的結(jié)腸樣品中代謝組學(xué)譜的三維散點圖

表1 避水應(yīng)激和母嬰分離引起結(jié)腸組織中代謝產(chǎn)物的變化情況

3 結(jié)語

已有研究表明spexin 作為內(nèi)源性神經(jīng)肽參與胃腸道功能的調(diào)節(jié)以及焦慮抑郁的發(fā)生過程.然而在應(yīng)激狀態(tài)下胃腸道中spexin 是否發(fā)生變化和參與了腸道運動調(diào)控尚需進一步研究.本研究采用2種不同的應(yīng)激大鼠模型(WAS 和NMS)初步探討了應(yīng)激誘導(dǎo)的結(jié)腸組織中spexin 以及相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化情況.

在應(yīng)激模型中，大鼠的腸道運動顯著增加，這一現(xiàn)象與前期研究發(fā)現(xiàn)保持一致[20].由于本研究同時采用了WAS 和NMS 2種應(yīng)激模型，因此在觀察對照組糞便顆粒數(shù)量的時候設(shè)置了與避水應(yīng)激組相對應(yīng)的對照模式(無水池，中間設(shè)置高臺)，這可能會導(dǎo)致對照組大鼠出現(xiàn)輕微的應(yīng)激狀態(tài)，因此造成NMS 組大鼠與對照組大鼠之間差異不顯著.然而在雙重應(yīng)激組的大鼠中表現(xiàn)出的疊加效應(yīng)反映了NMS 造成的大鼠應(yīng)激同樣會引起腸道運動增加.為了探討應(yīng)激誘導(dǎo)的腸道運動增加是否與spexin 信號調(diào)控有關(guān)，對大鼠結(jié)腸組織中spexin 和GALR2 受體的表達進行了檢測.在應(yīng)激模型大鼠近端結(jié)腸中，spexin 與GALR2 表達量均表現(xiàn)出較大幅度的顯著升高.而遠(yuǎn)端結(jié)腸中GALR2 表達差異不顯著，同時spexin 的變化幅度明顯小于近端結(jié)腸.說明在應(yīng)激所導(dǎo)致的spexin 信號調(diào)控變化可能主要發(fā)生在近端結(jié)腸部位.

代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，大鼠應(yīng)激后其結(jié)腸中相當(dāng)一部分代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化.其中性激素代謝(如孕酮)、鞘脂代謝(如O-磷酸乙醇胺)、α亞麻酸和亞油酸代謝(如亞油酸)、脂肪酸代謝(如琥珀酸和一磷酸腺苷)等代謝通路差異顯著.這些發(fā)現(xiàn)為針對應(yīng)激誘導(dǎo)的胃腸道疾病的發(fā)病機理研究提供腸道代謝組方面的科學(xué)依據(jù).前期研究發(fā)現(xiàn)，spexin 能調(diào)節(jié)小鼠肝臟，腸道以及血清中的膽汁酸等脂代謝通路[8]，由此推測上述代謝通路的變化或與spexin 的表達改變有關(guān).后期針對spexin 在應(yīng)激狀態(tài)下對脂代謝的調(diào)控進一步深入研究將有利于闡明spexin 在胃腸道中的生理功能以及spexin 在胃腸道疾病發(fā)病機理中的作用.