席曉萌，姜云鴿，王 琳，黃相中，田 凱

(1.云南民族大學(xué) 理論與計算化學(xué)實驗室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

糖尿病是一種全球性的常見的慢性疾病，是由遺傳、肥胖、免疫功能紊亂及感染等因素造成的，該病會使患者的胰島功能減退甚至喪失生物功能，從而導(dǎo)致糖、蛋白質(zhì)、電解質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)高血糖癥[1-2].患者如果長期不能控制自己的血糖達(dá)到正常水平，就會引發(fā)全身性的糖尿病并發(fā)癥，諸如糖尿病腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化等[3-4].現(xiàn)階段，糖尿病已成為危害人類健康的重要疾病之一，防治糖尿病及其并發(fā)癥是一項關(guān)乎全人類健康的艱巨工程.糖尿病患者一經(jīng)發(fā)病，往往很難治愈，只能終生服用各類降糖類藥物或者注射胰島素.

在上世紀(jì)八十年代，臨床研究發(fā)現(xiàn)了α-葡萄糖苷酶抑制劑，并且將其研制成為了一種新型口服降糖類藥物，該藥在治療過程中特別是對餐后血糖的控制上有著較大的優(yōu)勢：食物當(dāng)中含有大量的碳水化合物，經(jīng)過口腔唾液和胰淀粉酶的消化作用后會變成含有少量葡萄糖分子的低聚糖，而α-葡萄糖苷酶則會在這些低聚糖的非還原末端產(chǎn)生作用，進(jìn)而釋放葡萄糖，通過小腸粘膜細(xì)胞吸收后進(jìn)入到血液循環(huán)當(dāng)中，導(dǎo)致血糖升高[5].而α-葡萄糖苷酶抑制劑可以降低機體對葡萄糖的吸收，同時也能抑制機體內(nèi)碳水化合物的代謝，并將原有的葡萄糖分子進(jìn)行分解，成為小分子葡萄糖.所以，這類抑制劑能夠?qū)崿F(xiàn)對機體血糖良好的控制，尤其是在調(diào)控2型糖尿病時更加有效，特別適合中老年糖尿病患者的使用.這類藥物主要包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等[6-7].

黃酮類化合物泛指通過一個三碳原子實現(xiàn)2個酚羥基的苯環(huán)(A環(huán)，B環(huán))的聯(lián)結(jié)，由此所形成的若干種化合物，其基本母核為2-苯基色原酮.黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團.此外，它還常與糖結(jié)合成苷[8].黃酮類化合物廣泛存在于天然的植物和中草藥中，正是依賴于這些中草藥，使黃酮類化合物的獲取變得相對容易，給研究開展提供了便利.表1展示的是一些黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式：

表1 常見的黃酮類化合物結(jié)構(gòu)式

研究表明，黃酮類化合物的生理活性與藥理活性都相對較多，在抗炎癥、抗氧化、抗糖尿病并發(fā)癥以及抗癌癥等方面都能夠產(chǎn)生一定的療效[9-11].黃酮類化合物擁有毒性低的特點，在一些食物或者化妝品中都有添加.近幾年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)葛根異黃酮類化合物具有降血糖、降血脂及擴張冠狀血管的作用[12]；梅桂雪等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物可以通過抑制 Maillard 反應(yīng)、增強機體對葡萄糖的攝取、抑制醛糖還原酶、促進(jìn)胰島素的分泌、作用于血管緊張素、抑制α-葡萄糖苷酶等，發(fā)揮防治糖尿病的作用；銀杏黃酮能使患有2型糖尿病的病人血小板中丙二醛的水平顯著降低，以此實現(xiàn)對β細(xì)胞更為有效的保護，同時還能夠使細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度相應(yīng)提升，通過其對蛋白激酶Ⅱ的依賴性，實現(xiàn)對胰島素分泌的調(diào)控[14].現(xiàn)階段，新型的、高效的、低毒的抗糖尿病藥物是藥物研發(fā)的主流，依據(jù)黃酮類化合物的多種優(yōu)勢，可以將其作為研制新型α-葡萄糖苷酶抑制劑類抗糖尿病藥物的活性組分.

分子對接(molecular docking)是指從藥物小分子以及蛋白大分子各自的三維結(jié)構(gòu)入手，檢驗兩者能不能結(jié)合，同時預(yù)測結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法.尋找藥物分子與受體蛋白之間合理的結(jié)合模式，是分子對接的根本[15].當(dāng)前，計算機輔助藥物設(shè)計(computer aided drug design，CADD)成為藥物研發(fā)中比較靠譜的新方法，而分子對接技術(shù)作為CADD的重要方法之一，由于相對廉價及效果突出，成為了尋找和檢索先導(dǎo)化合物的重要手段[16].α-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大類酶，主要功能為水解葡萄糖苷鍵，釋放出葡萄糖作為產(chǎn)物，是生物體糖代謝途徑中不可或缺的一類酶.α-葡萄糖苷酶來源廣泛，幾乎存在于所有以碳水化合物為能源的且具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物體內(nèi)，因此可以作為分子對接中的受體蛋白使用.常用的分子對接軟件有Dock、AutoDock和Discovery Studio等，本文將使用Discovery Studio 2.5軟件中的半柔性對接(Libdock)模塊來進(jìn)行分子對接分析[17-18]，用以揭示受體蛋白(α-葡萄糖苷酶)和藥物(黃酮類化合物)之間的相互作用關(guān)系，為研制新型α-葡萄糖苷酶抑制劑類抗糖尿病藥物提供理論計算基礎(chǔ).

1 計算詳情

1.1 配體小分子的準(zhǔn)備

本文所使用的44個黃酮類化合物均由云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會-教育部重點實驗室提供.將上述小分子分別用DS軟件畫出，保存為sdf格式文件，并放在同一文件夾下.為了實現(xiàn)批量的在DS軟件中進(jìn)行分子對接分析，將上述文件夾中的44個sdf文件整合成一個復(fù)合的文件，DS軟件可以一次性地對所有配體小分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行讀取.

1.2 受體蛋白的準(zhǔn)備

通過RCSB PDB(http://www1.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫按照關(guān)鍵詞“α-glucosidase”進(jìn)行搜索，獲取相應(yīng)的PDB格式的蛋白.本文使用的是PDB編號為3TOP的蛋白作為受體蛋白進(jìn)行分子對接研究.

1) 將下載好的蛋白通過DS 2.5軟件打開，進(jìn)行去水、加氫、補充非完整氨基酸殘基等操作；

2) 將蛋白顯示方式更改為絲帶狀顯示，以方便后續(xù)觀察；

3) 將蛋白定義為受體分子，并選擇自動查找可能的有效結(jié)合位點，這樣有助于獲取活性較高的位點；

4) 給結(jié)合位點定義球型區(qū)域，每個位點要單獨定義，區(qū)域在完全包裹位點的前提下盡可能小，以此來提高對接效率和精度.

1.3 分子對接仿真運行

將處理后的受體蛋白通過DS軟件中Protocols面板中Dock Ligand (Libdcok)方法與小分子復(fù)合文件進(jìn)行分子對接分析.部分對接示意圖如圖1所示.

圖1 44個黃酮類小分子與3TOP蛋白8號位點分子對接示意圖

2 結(jié)果與分析

自動獲取的活性位點是按照活性大小從高往低排列的，該計算中受體蛋白一共獲取了33個位點，選取其中前8個位點進(jìn)行分析，以LibDock Score打分為標(biāo)準(zhǔn)，分?jǐn)?shù)排在第1位的就是軟件認(rèn)為最好的結(jié)合方式.文中選取了8個位點對接結(jié)果中排名前10的對接結(jié)果進(jìn)行分析，前10個對接結(jié)果如表2所示.

由表2可以看出，HT15配體與受體蛋白3TOP對接分?jǐn)?shù)最高，說明HT15分子與蛋白結(jié)合程度最為緊密；之后的HT18、HT7一直到HT21配體對接分?jǐn)?shù)都達(dá)到了130以上，說明這些配體與受體蛋白也具有強的相互作用.推測以上配體可能是抑制α-葡萄糖苷酶的有效成分.為了方便觀察與分析配體與受體之間的相互作用，將上述對接排名前四的結(jié)果生成三維圖和二維圖.

表2 對接結(jié)果分?jǐn)?shù)表(排名前10)

續(xù)表2

圖2和圖3展示的是HT15分子與3TOP蛋白對接結(jié)果三維和二維圖，由上圖可知，配體和受體之間存在強的相互作用，主要作用類型包括氫鍵、π鍵、π-π共軛效應(yīng)和疏水作用等，例如：HT15與蛋白3TOP的殘基ASN 1583、CYS 1249、GLU 1258、SER1261、HIS 1584形成了5個氫鍵，具有很強的氫鍵作用；TRY1253與配體的芳香環(huán)形成了穩(wěn)定的π-π疏水堆積作用；ARG 1250和LEU1262的陽離子與苯環(huán)的π電子之間存在p-π共軛效應(yīng)；ASP1593與ARG1591也有相似的作用，其陰離子與配體的苯環(huán)形成了共軛效應(yīng)；此外，HT15與一些疏水氨基酸如ASN1585、GLN1592、LEU1248、ILE1259、GLU1265存在很強的疏水作用，推測ARG1591在HT15與3TOP相互作用中起到了關(guān)鍵作用.以上結(jié)果說明HT15分子與3TOP受體蛋白之間存在強的抑制作用.

圖2 HT15分子與3TOP蛋白8號位點對接三維圖

圖3 HT15分子與3TOP蛋白8號位點對接二維圖

圖4和圖5展示的是HT18分子與3TOP蛋白對接結(jié)果的三維和二維圖，由上圖可知，配體和受體之間存在強的相互作用，主要作用類型包括氫鍵、π-π共軛效應(yīng)和疏水作用等.例如：HT18與3TOP蛋白殘基ARG1504、ILE 1758形成了2個氫鍵，附近也存在一些較弱的碳?xì)滏I，如ASP1759；HIS1627與配體的芳香環(huán)形成穩(wěn)定的π-π疏水堆積作用，VAL1237和MET1238的陽離子與苯環(huán)的π電子之間存在p-π共軛效應(yīng)；此外，HT18與一些疏水氨基酸如HIS1624、TYR1761、PHE1751、ASP1753、THR1760、SER1757、TYR1494、GLN1498、TRP1519、ARG1518、THR1628存在很強的疏水作用.以上結(jié)果說明HT18分子與3TOP受體蛋白之間存在強的抑制作用.

圖4 HT18分子與3TOP蛋白6號位點對接三維圖

圖6和圖7展示的是HT7分子與3TOP蛋白對接結(jié)果的三維和二維圖，由上圖可知，配體和受體之間存在強的相互作用，主要作用類型包括氫鍵、π鍵和疏水作用等.例如：HT7與3TOP蛋白殘基SER1261、CYS 1249、ASN1583形成了3個氫鍵，具有很強的氫鍵作用；LEU1262、ARG1250和ARG1591的陽離子與苯環(huán)的π電子之間存在p-π共軛效應(yīng)；ASP1593與ARG1591也有相似的作用，其陰離子與配體的苯環(huán)形成了共軛效應(yīng)；此外,HT7與一些疏水氨基酸如GLU1258、GLU1265、TYR1253、GLN1592、ASN1585、HIS1584、LEU1248存在很強的疏水作用，推測ARG1591在HT7與3TOP相互作用中起到了關(guān)鍵作用.以上結(jié)果說明HT7分子與3TOP受體蛋白之間存在強的抑制作用.

圖6 HT7分子與3TOP蛋白8號位點對接三維圖

圖7 HT7分子與3TOP蛋白8號位點對接二維圖

圖8和圖9展示的是HT17分子與3TOP蛋白對接結(jié)果的三維和二維圖，由上圖可知，配體和受體之間存在強的相互作用，主要作用類型包括氫鍵、π鍵和疏水作用等.例如：HT17與3TOP蛋白殘基ARG 1410、ARG1333、GLU1397形成了4個氫鍵，具有很強的氫鍵作用，值得注意的是，GLU1397不僅提供氫鍵的受體，本身形成氫鍵也提供了質(zhì)子，附近也存在一些較弱的碳?xì)滏I，如GLU 1400、PHE 1289；LEU1412、LEU1401和PRO1405的陽離子與苯環(huán)的π電子之間存在p-π共軛效應(yīng)；GLU1400與ARG1410也有相似的作用，其陰離子與配體的苯環(huán)形成了共軛效應(yīng)；PRO1329與配體形成了穩(wěn)定的p-π疏水堆積作用；此外，HT17與一些疏水氨基酸如PRO1299、SER1411、GLN1406、ASN1404、ALA1330、TYR1282、THR1290、LEU1291存在很強的疏水作用，推測ARG1410和GLU1397在HT17與3TOP相互作用中起到了關(guān)鍵作用.以上結(jié)果說明HT17分子與3TOP受體蛋白之間存在強的抑制作用.

圖8 HT17分子與3TOP蛋白3號位點對接三維圖

圖9 HT17分子與3TOP蛋白3號位點對接二維圖

3 結(jié)語

一個新藥的問世，是一個十分漫長的過程.在藥物的篩選過程中，如果每一個新化合物都進(jìn)行藥理實驗研究，那將浪費很多人力、物力、財力，且根本無法跟上新化合物發(fā)現(xiàn)的節(jié)奏.計算機輔助藥物設(shè)計開拓了新的藥物研究領(lǐng)域和方法，從分子水平研究藥物與受體相互作用.利用計算機虛擬藥物篩選技術(shù)篩選化合物作用靶點，為后續(xù)實驗研究提供強有力的理論支撐，使得實驗研究具有較強的導(dǎo)向性.

文中主要采用分子對接的方法，研究了實驗室獲得的幾十種黃酮類化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合模式和作用機制，明確了可能的結(jié)合位點，旨在從分子水平上闡明藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系.本文基于受體蛋白分子3TOP的晶體結(jié)構(gòu)，通過一系列模擬計算，推測出ARG1591、ARG1410和GLU1397可能為受體的活性位點殘基；得到了排名前十的對接結(jié)果，進(jìn)一步篩選出9個可以起到較強抑制作用的黃酮類化合物：HT15、HT18、HT7、HT17、HT23、HT2、HT16、HT43、HT21，它們是通過不同的位點發(fā)揮藥效；選擇上述前4結(jié)果生成相互作用模式圖并加以分析，證實了上述黃酮類化合物作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的可行性，說明了本研究應(yīng)用上述介紹的分子優(yōu)化對接方法來進(jìn)行相關(guān)計算是可靠的，能夠為新型α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物的研究提供一定的理論計算依據(jù).