孔慧 崔彥

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是最常見的糖尿病特異性并發(fā)癥之一，也是成年人低視力和致盲的主要原因。目前治療DR的方法主要有視網(wǎng)膜激光光凝、玻璃體內(nèi)注藥和玻璃體切割術(shù)等。然而，這些治療方法并不能完全控制DR病情，因此探討早期 DR的有效預(yù)防措施具有重要意義。越來越多的研究認(rèn)為，炎癥和免疫系統(tǒng)失調(diào)是DR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[1-2]。近年來隨著視網(wǎng)膜神經(jīng)血管單元(RNVU)[3]的提出，人們認(rèn)為糖尿病代謝改變引起的炎癥反應(yīng)不僅損傷視網(wǎng)膜的微血管，而且會損傷神經(jīng)血管單元，導(dǎo)致逐漸發(fā)生進(jìn)行性的神經(jīng)病變[4-5]。CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎癥信號通路參與RNVU中細(xì)胞間信

號傳遞，放大炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞程序性死亡，是毛細(xì)血管退化和視網(wǎng)膜缺血發(fā)展的關(guān)鍵。本文對近年來DR炎癥機(jī)制的研究進(jìn)展以及CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎癥信號通路在DR中的作用進(jìn)行綜述。

1 炎癥與DR的關(guān)系

炎癥與DR的關(guān)系是1993年由Tang等[6]首先報(bào)道的，他們發(fā)現(xiàn)DR患者玻璃體中的免疫細(xì)胞增多且細(xì)胞因子表達(dá)水平升高。Powell 等[7]對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的糖尿病患者使用水楊酸治療時(shí)，發(fā)現(xiàn)DR發(fā)病率低于預(yù)期，提示DR與炎癥反應(yīng)有關(guān)。在對糖尿病動物和患者的大量研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)對象的視網(wǎng)膜或玻璃體液均會發(fā)生與炎癥反應(yīng)一致的各種生理和分子異常[8-9]。Idit 等[10]采用前瞻性研究設(shè)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，增生型DR患者視網(wǎng)膜出現(xiàn)與炎癥高度相關(guān)的凝血因子，且患者視網(wǎng)膜組織血管生成因子活性升高，進(jìn)一步證實(shí)DR的發(fā)病機(jī)制與炎癥和免疫系統(tǒng)失調(diào)相關(guān)。

1.1 DR中的炎癥反應(yīng)炎癥是由宿主免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的防御過程，是機(jī)體重要的生理過程。視網(wǎng)膜組織有高度敏感的免疫系統(tǒng)[11]。這些免疫通路失去調(diào)控，就會對周圍宿主組織構(gòu)成威脅，發(fā)生炎癥反應(yīng)。在急性血糖升高時(shí)，宿主外周血腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6 和IL-18等細(xì)胞因子的含量升高[12]，中性粒細(xì)胞數(shù)量也升高[13]。非增生型DR患者的眼部組織中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等多種炎癥因子含量升高，其中IL-8和TNF-α的水平甚至高于活躍的增生型DR患者[14]。有人采用玻璃體氧化誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變大鼠模型模擬增生型DR病程，模型大鼠NF-κβ基因以及IL- 6和TNF-α的蛋白表達(dá)顯著增加[15]，說明在DR早期、非增生期及新生血管期各個(gè)階段都有炎癥反應(yīng)。

持續(xù)或低強(qiáng)度的刺激使靶組織處于長期或過度炎癥反應(yīng)時(shí)，可導(dǎo)致機(jī)體處于非可控性炎癥狀態(tài)[16]。糖尿病時(shí)宿主體內(nèi)代謝異常導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞活化，長期的組織應(yīng)激促使視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞變得反應(yīng)過度，并促進(jìn)炎癥因子分泌。而Müller細(xì)胞通過CD40-ATP-P2X7途徑協(xié)調(diào)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，造成RNVU的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，形成慢性炎癥性視網(wǎng)膜環(huán)境，進(jìn)一步引起視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞死亡，毛細(xì)血管變性[17]。DR時(shí)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的分泌會導(dǎo)致其他膠質(zhì)細(xì)胞的激活，如星形膠質(zhì)細(xì)胞，放大視網(wǎng)膜中的炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致不可控性的慢性低度炎癥反應(yīng)。

1.2 糖尿病引起視網(wǎng)膜炎癥的因素高糖、嘌呤產(chǎn)物、高血脂、高眼壓、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮生長因子、晚期糖基化終末產(chǎn)物、循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)或玻璃體內(nèi)高水平的細(xì)胞因子和趨化因子、氧自由基、細(xì)胞凋亡碎片以及糖尿病本身的免疫損傷都與DR時(shí)炎癥激活有關(guān)[18-19]。高血糖本身是一種促炎環(huán)境[20]，高糖可上調(diào)大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和趨化因子CCL2的表達(dá)[21]。小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜的常駐免疫細(xì)胞[22]，是許多生長因子和炎癥因子的重要來源，激活后產(chǎn)生大量的炎癥因子，并遷移至外層視網(wǎng)膜。持續(xù)的高血糖導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞過度分泌大量的促炎癥因子，導(dǎo)致慢性炎癥、血-視網(wǎng)膜屏障損傷和DR的病理惡化，抑制視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化能選擇性地減輕糖尿病視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)[23]。

ATP是機(jī)體的重要代謝產(chǎn)物。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有高達(dá)5～10 mmol·L-1ATP?；A(chǔ)代謝條件下ATP在細(xì)胞外以非常低的濃度存在，細(xì)胞損傷和死亡后以高濃度釋放。細(xì)胞外ATP作為一種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號，參與體內(nèi)多種炎癥反應(yīng)，在炎癥細(xì)胞的趨化、吞噬和分泌等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[24]，包括肺部炎癥和纖維化、全身炎癥和內(nèi)毒素血癥過程中的組織損傷。Costa等[25]采用體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高糖通過增加ATP的胞外釋放和減少降解，改變了視網(wǎng)膜中的嘌呤能信號系統(tǒng)。由此產(chǎn)生的高水平的細(xì)胞外ATP可能導(dǎo)致炎癥參與DR的發(fā)病過程。

2 CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎癥信號通路參與神經(jīng)血管單元細(xì)胞間信號串?dāng)_

神經(jīng)血管單元(neurovascular unit)是用于血-腦屏障的術(shù)語，Eric將這個(gè)概念應(yīng)用于視網(wǎng)膜，指神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管之間復(fù)雜的功能耦合，視網(wǎng)膜微血管與神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞緊密關(guān)聯(lián)，組成RNVU。這些細(xì)胞密切協(xié)調(diào)，整合視網(wǎng)膜血管中血液流動與代謝活動，在DR的臨床特征出現(xiàn)之前，就已出現(xiàn)這些受損的生理反應(yīng)[26]。神經(jīng)元、血管細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和局部免疫細(xì)胞之間相互作用的破壞，與早期DR的進(jìn)展有關(guān)。因此，制定新的治療策略來預(yù)防或逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)炎癥和受損的細(xì)胞間相互作用是有意義的[27]。Müller細(xì)胞通過P2X7激活介導(dǎo)TNF-α和IL-1β分泌的CD40-ATP-P2X7通路，參與RNVU炎癥反應(yīng)中細(xì)胞間信號串?dāng)_(cell to cell cross-call)，對此通路各靶點(diǎn)以及上下游信號分子的抑制有助于減輕DR中的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步控制DR的早期病變。

2.1 CD40/CD40L軸CD40是TNF受體超家族的成員，CD40-CD40L通路是自身免疫和適應(yīng)性免疫的核心。糖尿病小鼠視網(wǎng)膜CD40基因及蛋白表達(dá)均上調(diào)[28]。糖尿病患者外周血中可溶性CD40受體sCD40L水平升高[29]。sCD40L的水平與DR的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可以預(yù)測DR的嚴(yán)重程度[30]。CD40對于DR中的炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。

CD40在視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中具有低水平的基礎(chǔ)表達(dá)。高糖狀態(tài)下細(xì)胞表面過表達(dá)CD40，從而引起炎癥反應(yīng)，Müller細(xì)胞上CD40與配體結(jié)合后通過釋放ATP和上調(diào)P2X7雙重機(jī)制誘導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞程序性死亡，這可能是DR血管損傷的重要因素[17]。CD40缺陷小鼠表現(xiàn)出與DR相關(guān)的炎癥反應(yīng)減弱[31]。CD40-/-的糖尿病小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞不會發(fā)生細(xì)胞間黏附分子-1、TNF-α、IL-1β、趨化因子CCL2 mRNA表達(dá)上調(diào)，白細(xì)胞黏附以及毛細(xì)血管變性[17,31]。

2.2 ATP和嘌呤能信號通路ATP是生理狀態(tài)下維持細(xì)胞代謝功能的主要能量物質(zhì)，在應(yīng)激狀態(tài)下可作為損傷信號分子被釋放到細(xì)胞外調(diào)控多種細(xì)胞效應(yīng)[32]。DR患者視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放ATP 介導(dǎo)嘌呤信號能受體激活一系列下游信號引起炎癥反應(yīng)[31]。ATP既可以在細(xì)胞損傷及死亡后釋放，也可以通過不同的通道從活細(xì)胞中釋放，如連接蛋白、半通道蛋白或特定的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通道。幾乎所有細(xì)胞在特定的刺激下均可釋放ATP至胞外[33]。

嘌呤能信號參與介導(dǎo)視網(wǎng)膜的損傷及變性，在缺血缺氧、高眼壓和糖尿病等致病條件下，CD40通路被激活，釋放ATP作為一種內(nèi)部危險(xiǎn)信號，激活視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞嘌呤能受體P2X7，促進(jìn)炎癥反應(yīng)以及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的程序性死亡。嘌呤能受體包括P1型和P2型。其中P1受體是腺苷受體，P2受體優(yōu)先被ATP和ADP激活。P2受體又分為兩個(gè)不同的亞家族：配體門控離子通道型受體P2X和G蛋白偶聯(lián)受體P2Y。P2X受體是由7種不同亞型組成，命名為P2X1、2、3、4、5、6、7。P2Y受體由8種不同亞型組成，命名為P2Y1、2、4、6、11、12、13、14[34]。其中P2X7是目前研究最多的受體[35]。

2.3 P2X7受體P2X7受體在視網(wǎng)膜多種類型的細(xì)胞上表達(dá),包括神經(jīng)細(xì)胞(如神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞等)。在ATP短暫刺激下，P2X7受體陽離子通道打開,導(dǎo)致K+外流以及Na+、Ca2+內(nèi)流。在ATP 持續(xù)刺激下，P2X7受體會形成非選擇性膜孔，允許一些相對分子質(zhì)量達(dá) 9×106的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[36]。由ATP過度激活P2X7受體觸發(fā)的鈣信號失調(diào)是誘導(dǎo)神經(jīng)元和微血管細(xì)胞死亡的關(guān)鍵步驟[37]，P2X7信號也能通過激活K+和Ca2+通道放大高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[38]。依賴P2X7的細(xì)胞因子表達(dá)升高會促進(jìn)DR的發(fā)生與發(fā)展[39]。激活P2X7受體會導(dǎo)致視網(wǎng)膜周細(xì)胞釋放IL-1β，進(jìn)一步促進(jìn)周細(xì)胞丟失，而損害血-視網(wǎng)膜屏障的完整性，導(dǎo)致血管滲漏和黃斑水腫[40]。P2X7受體被認(rèn)為是多種眼部疾病的潛在藥理學(xué)靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)跨內(nèi)皮電阻和細(xì)胞間連接在維護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障的完整性中發(fā)揮重要作用[41]。P2X7受體拮抗劑可以阻止視網(wǎng)膜微血管中由于P2X7激活而引起的細(xì)胞線粒體功能的改變和細(xì)胞通透性的改變，在治療DR中發(fā)揮作用[42]。

P2X7受體是ATP刺激視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化并分泌IL-1β和TNF-α的關(guān)鍵[38,42]。藥物途徑阻斷P2X7受體，敲除P2X7或使用巨噬細(xì)胞P2X7-/-小鼠，可使視網(wǎng)膜TNF-α和IL-1β表達(dá)下調(diào)，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少[39]。目前，正在進(jìn)行I期/Ⅱ期選擇性P2X7受體拮抗劑的臨床試驗(yàn)評估[43]。P2X7受體抑制劑JNJ47965567能有效降低高糖對人周細(xì)胞的損傷作用[37]，對糖尿病大鼠腹腔注射小分子P2X7受體抑制劑A740003和AZ10606120，對血糖無影響，但可以完全逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜血管通透性增加、VEGF積聚和IL-6高表達(dá)。核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑拉米夫定，是一種新發(fā)現(xiàn)的P2X7受體抑制劑，可以減弱DR小鼠神經(jīng)元和血管病變的進(jìn)展，用拉米夫定治療后糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中的無細(xì)胞毛細(xì)血管數(shù)量減少[44]。

2.4 P2X7/NLRP3受體P2X7受體是陽離子門控通道，可允許K+、Na+、Ca2+等離子通過,而細(xì)胞內(nèi)K+外流又是NLRP3、caspase-1激活以及前體和成熟巨噬細(xì)胞中IL-1β釋放的關(guān)鍵信號通路[45]。功能性NLRP3炎性小體的關(guān)鍵成分是NLRP3、適配器蛋白ASC和caspase-1。細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激后，NLRP3招募ASC和pro-caspase-1，導(dǎo)致caspase-1激活并促進(jìn)細(xì)胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和分泌。細(xì)胞外ATP激活P2X7/NLRP3炎癥信號通路參與非酒精性脂肪性肝病理過程[35]。在中樞和脊髓神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中P2X7/NLRP3炎癥信號通路也起著至關(guān)重要的作用[46-47]。慢性高眼壓時(shí)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中P2XR/NLRP3通路的激活可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡[48]。

P2X7受體和NLRP3炎性小體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)相互作用并共同定位，NLRP3炎性小體將P2X7受體激活后K+通道打開，K+外流激活NLRP3，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[49]。NLRP3炎性小體的激活是視網(wǎng)膜病變中促炎作用進(jìn)展的關(guān)鍵，抑制P2X7受體可間接降低NLRP3炎性小體的激活。高糖增加了大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3炎性小體的表達(dá)，體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下，NLRP3炎性小體及其下游細(xì)胞因子的水平顯著升高[50]。早期應(yīng)用非諾貝特可通過 P2X7/NLRP3 炎癥信號通路延緩DR的發(fā)展[51]。

3 小結(jié)

DR是糖尿病的常見并發(fā)癥，可引起不可逆的視網(wǎng)膜損傷。DR是目前工作年齡的成年人視力喪失的主要原因。盡管抗VEGF治療已成為治療DR一線療法并獲得較好療效，但仍存在許多不足，如重復(fù)的眼內(nèi)注射、僅對疾病晚期有效、有效率較低[52]。探討DR的發(fā)病機(jī)制尋找新的治療靶點(diǎn)仍然非常有意義。CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎癥信號通路在RNVU中起著細(xì)胞間信號串?dāng)_作用，對該通路進(jìn)行抑制可以減輕DR炎癥反應(yīng)。強(qiáng)效小分子P2X7受體抑制劑A740003以及AZ10606120能夠逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管通透性增加，降低視網(wǎng)膜中的VEGF和IL-6基因和蛋白表達(dá)[44]。因此,對該信號通路的研究為DR的早期干預(yù)和治療提供了新的靶點(diǎn)。