張 濛，續(xù)高山，滕志遠，劉關(guān)君，張秀麗，3*

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院,黑龍江 哈爾濱 150040；2.林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學),黑龍江哈爾濱 150040;3.東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學)，黑龍江 哈爾濱 150040)

對于植物而言，酸雨已成為常見的非生物脅迫之一，不同的植物對于酸雨脅迫的響應(yīng)不同[1-2]，當酸雨的酸度超過植物的耐受極限時，植物葉片會出現(xiàn)變黃、脫落、衰老甚至死亡等現(xiàn)象[3]。更多的研究表明，植物通過調(diào)整體內(nèi)生理生化過程應(yīng)對酸雨脅迫表現(xiàn)出一定的耐受性。光合作用是植物體內(nèi)重要生理過程，電子傳遞過程中容易受逆境脅迫而產(chǎn)生過剩的活性氧，一部分活性氧被活性增強的抗氧化酶消除[4]，一部分則與植物細胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)[維生素E(VE)、維生素C(VC)]結(jié)合[5]。而過剩活性氧可能會破壞光合機構(gòu)[6]，常表現(xiàn)為光能利用率下降[7]和光合電子傳遞受阻[8]等，造成植物光合能力減弱。研究發(fā)現(xiàn)：重度酸雨(pH≤3.5)處理的桑樹(Morusalba)葉片光系統(tǒng)Ⅱ活性和電子由QA到QB傳遞受阻[9]；而適度的酸雨脅迫(pH≥4.5)可促進桑樹葉片瞬時凈光合速率，緩解光合午休，而其光系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞并未受到限制[10]。

小黑楊(Populussimonii×P.nigra)適應(yīng)能力很強，且具有生長迅速、成林早等優(yōu)良性狀[11]，在工業(yè)用材、植被防護、涵養(yǎng)水源、固碳儲碳、改善氣候等方面發(fā)揮重要作用，廣泛種植于我國三北地區(qū)[12]。目前關(guān)于逆境對楊樹生長及生理特性的研究多集中在低溫[13]、鹽脅迫[14-15]及干旱脅迫[16]等方面。國內(nèi)關(guān)于酸雨對楊樹生長影響的研究較少，僅有酸雨對歐美楊南方型‘1-72’楊(Populus×euramericana)的生長及木材化學性質(zhì)的影響[17]和白毛楊(Populustomentosa)生長及敏感性[18]的報道，有關(guān)小黑楊保護酶和光系統(tǒng)Ⅱ活性對于酸雨響應(yīng)情況的相關(guān)報道較少。葉綠素熒光技術(shù)被稱為光合作用研究的探針，可無損、快速地反映光合作用過程。因此，本研究以小黑楊幼苗生長指標及葉片結(jié)構(gòu)及部分活性氧、抗氧化物酶和葉綠素熒光參數(shù)為研究內(nèi)容，探討小黑楊對于酸雨的響應(yīng)狀況，以期為在酸雨沉降日趨嚴重的北方地區(qū)[19]合理栽植小黑楊提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用小黑楊(P.simonii×P.nigra)最早是由中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所人工雜交育成。本研究所用小黑楊插條取自東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室實驗林場(126°62.87′E，45°71.97′N)，從同一株小黑楊插條獲得的幼苗，截頂生根后移至蛭石中，澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液[20]。試驗于2017年4月20日在東北林業(yè)大學植物生理室外酸雨棚中進行。

1.2 試驗設(shè)計

1.3 測定方法

快速葉綠素熒光動力學曲線(OJIP)的測定：試驗對象為不同處理下長勢相對一致的3株幼苗(即3次重復)。試驗儀器選擇Mini調(diào)制式掌上葉綠素熒光儀(FluorPenFP100max，捷克)。首先對小黑楊幼苗頂端向下數(shù)第4片葉(完全展開)進行暗處理30～45 min。然后，根據(jù)測得的數(shù)據(jù)繪制0.01～1 000.00 ms的OJIP曲線，同時對OJIP曲線進行JIP-test分析[21]。根據(jù)公式，以時間為橫坐標、相對熒光值為縱坐標分別繪制標準化O-P、O-K、O-J曲線。為使各處理與對照之間的差異更加直觀、準確，分別將pH 4.5和pH 2.5酸雨處理標準化O-P、O-J和O-K曲線與CK之間作差，并分別用ΔVO-P、ΔVO-J與ΔVO-K表示。

VI= (Ft-Fo)/(FI-Fo)，

VJ= (Ft-Fo)/(FJ-Fo)，

VK= (Ft-Fo)/(FK-Fo)，

VL= (Ft-Fo)/(FL-Fo)。

其中：O、L、K、J、I、P點分別代表曲線上0、0.15、0.3、2.00、30.00和1 000.00 ms所對應(yīng)的熒光強度，分別用FO、FI、FJ、FP、FK和FL表示對應(yīng)點的相對可變熒光強度；VJ、VI、VK和VL分別是各時間點(t)的相對可變熒光值。

生長指標測定：對已測OJIP曲線對應(yīng)小黑楊幼苗，進行株高、莖粗、葉片數(shù)和葉面積測定。株高和莖粗分別利用直尺和游標卡尺進行測定；記錄各組小黑楊幼苗的葉片數(shù)，并用葉面積儀(Li-3000，美國)測量葉面積。

透射電鏡樣品制備：分別將切好的小黑楊幼苗葉片樣品(1 mm×1 mm×1 mm)用戊二醛和四氧化鋨固定液進行前固定與后固定，之后利用體積分數(shù)為50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液對其進行梯度脫水，再經(jīng)浸透包埋、聚合、修塊、定位和染色，利用透射電子顯微鏡(JEM-2100, 日本)對樣品進行觀察和拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 16.0和Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖，利用Duncan’s多重比較法進行差異顯著性分析，用3次重復數(shù)據(jù)的平均值±標準差作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸雨脅迫對小黑楊葉片表型及其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的影響

模擬酸雨處理下，小黑楊幼苗葉片表型及其解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化(圖1)：對照(CK)小黑楊葉片翠綠(圖1 A1)，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，類囊體排列緊湊，內(nèi)部分布著數(shù)量多、體積大的淀粉粒(圖1 B1、 C1)。pH 4.5模擬酸雨處理下，小黑楊葉片顏色轉(zhuǎn)呈黃綠色(圖1 A2)，但其葉綠體結(jié)構(gòu)完整，類囊體排列正常，未見淀粉粒，可見少數(shù)嗜鋨滴(圖1 B2、C2)；而pH 2.5模擬酸雨處理下，小黑楊幼苗葉片變黃程度加重，且葉尖和葉脈出現(xiàn)明顯的壞死病斑(圖1 A3)，其內(nèi)部細胞膜局部破裂，類囊體片層結(jié)構(gòu)紊亂，嗜鋨滴顆粒數(shù)量和體積明顯增多，淀粉粒數(shù)量少、體積小、色灰暗(圖1 B3、C3)。

A.葉片leaf;B.細胞cell;C.葉綠素chloroplast;Chl. 葉綠體 chloroplast；ChM. 葉綠體膜 chloroplast membrane；GL. 基粒片層 grana lamellae；OS. 嗜餓滴 osmiophilic；SG. 淀粉粒 starch grain；SL. 基質(zhì)片層 stroma lamellae；CW. 細胞壁 cell wall. A1.對照CK；A2.pH 4.5；A3.pH 2.5；B1.對照CK；B2.pH 4.5；B3.pH 2.5；C1.對照組CK；C2.pH 4.5；C3.pH 2.5。圖1 模擬酸雨對楊樹葉片表型和解剖結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of simulated acid rain on leaf phenotype and internal anatomy of Populus simonii ×P. nigra

模擬酸雨對小黑楊幼苗生長指標的影響如表1所示。其中，pH 4.5模擬酸雨處理小黑楊幼苗的株高、莖粗和葉片數(shù)較CK高出了23.09%(P< 0.05)、1.03%(P> 0.05)和36.84%(P< 0.05)，葉面積較CK降低了3.18%(P> 0.05)；而在pH 2.5模擬酸雨處理下小黑楊幼苗的株高和葉片數(shù)較CK變化較小。

表1 模擬酸雨對小黑楊幼苗生長指標的影響

2.2 酸雨脅迫對小黑楊葉片部分氧化和抗氧化指標的影響

表2 模擬酸雨對小黑楊幼苗葉片部分氧化和抗氧化指標的影響

2.3 酸雨脅迫對小黑楊葉片葉綠素熒光動力學曲線(OJIP)的影響

模擬酸雨脅迫改變了小黑楊幼苗葉綠素熒光動力學曲線(OJIP)的形態(tài)(圖2)。pH 4.5模擬酸雨處理的FO、FJ、FI、FP較CK分別升高了18.12%(P< 0.05)、13.30%(P< 0.05)、9.03%(P< 0.05)和9.33%(P< 0.05)；在pH 2.5模擬酸雨處理下，F(xiàn)O、FJ、FI、FP較CK分別升高了38.01%(P< 0.05)、20.22%(P< 0.05)、10.17%(P< 0.05)和8.21%(P< 0.05)。

將OJIP曲線進行標準化及標準化后做差發(fā)現(xiàn)，pH 4.5模擬酸雨處理下小黑楊幼苗的熒光參數(shù)VJ和VI略高于CK，但與CK差異不顯著性(P> 0.05)；而pH 2.5模擬酸雨處理下，小黑楊幼苗葉片的VJ和VI較CK分別升高了10.26%(P< 0.05)和1.67%(P< 0.05)，其中，VJ升高幅度大于VI。

不同小寫字母表示在0.05水平上相同參數(shù)在不同處理間差異顯著。下同。Data in the figure are mean ±SD, values followed by different small letters mean significant differences (P <0.05). The same below.圖2 模擬酸雨對楊樹幼苗葉片OJIP曲線的影響Fig.2 Effects of simulated acid rain on OJIP curve in the leaves of Populus simonii × P. nigra stecklings

圖3 模擬酸雨對小黑楊幼苗葉片標準化O-K和O-J曲線的影響Fig.3 Effects of simulated acid rain on standarded O-K and O-J curve in leaves of Populus simonii × P. nigra stecklings

模擬酸雨處理顯著提高了小黑楊幼苗葉片L點和K點的可變熒光強度(圖 3)。其中，pH 4.5模擬酸雨處理下小黑楊幼苗葉片的FL和FK與CK相比分別升高了20.51%(P< 0.05)和18.07%(P< 0.05)，pH 2.5模擬酸雨處理下小黑楊幼苗葉片的FL和FK較CK分別升高了43.22%(P< 0.05)和37.11%(P< 0.05)。將O-K曲線與O-J曲線標準化后可以發(fā)現(xiàn)，pH 4.5模擬酸雨處理小黑楊幼苗葉片的VL和VK與CK相比分別升高了5.31%(P< 0.05)和9.85%(P< 0.05)；pH 2.5模擬酸雨處理小黑楊幼苗葉片的VL和VK與CK相比分別升高了12.12%(P< 0.05)和21.16%(P< 0.05)。

2.4 酸雨脅迫對小黑楊葉片PSⅡ光化學活性的影響

不同pH的模擬酸雨處理均使得小黑楊幼苗葉片的最大光化學效率(Fv/Fm)和以光吸收為基礎(chǔ)的光合性能指數(shù)(PIABS)顯著下降(表3)。在pH 4.5模擬酸雨處理下，小黑楊幼苗葉片的Fv/Fm和PIABS較CK分別降低了2.21%(P< 0.05)和23.98%(P< 0.05)。小黑楊幼苗葉片的QA被還原的相對速率(MO)和熒光曲線與Fm之間的面積(Fix Area)與CK相比分別升高了12.34%(P> 0.05)和6.94%(P< 0.05)，PSⅡ受體側(cè)的電子受體庫容量(Sm)降低了19.54%(P> 0.05)；在pH 2.5模擬酸雨處理下，小黑楊幼苗葉片的Fv/Fm和PIABS較CK分別降低了5.58%(P< 0.05)和52.30%(P< 0.05)。小黑楊幼苗葉片的M0、Fix Area與CK相比分別升高了33.51%(P< 0.05)和8.48%(P< 0.05)，Sm降低了24.32%(P< 0.05)。

表3 模擬酸雨對小黑楊幼苗葉片光系統(tǒng)Ⅱ活性參數(shù)的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，適度的酸雨有利于茶樹(Camelliasinensis)[34]和馬尾松(Pinusmassoniana)[35]的生長。pH 4.5模擬酸雨處理的小黑楊幼苗葉片OJIP曲線上出現(xiàn)K點和L點，可能原因在于模擬酸雨持續(xù)噴施至檢測時，小黑楊幼苗葉片的PSⅡ電子傳遞在供體側(cè)受到影響，放氧復合體發(fā)生了可逆性失活。但主要熒光參數(shù)MO、Sm、VJ和VI與CK之間差異均不顯著，說明PSⅡ電子傳遞受體側(cè)未受明顯影響。同時，小黑楊的生長指標包括株高、莖粗、葉片數(shù)和葉面積均明顯高于CK。其可能的原因是適度酸雨(pH ≥ 4.5)作為礦質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)參與小黑楊代謝，有利于小黑楊的生長。

綜上所述，pH 2.5模擬酸雨處理小黑楊幼苗葉片的活性氧含量明顯增加，PSⅡ的受傷程度較為明顯，發(fā)生了不可逆的光抑制，原因在于PSⅡ中受體側(cè)放氧復合體OEC受到損傷，以及光合電子從QA向QB的傳遞受阻；pH 4.5模擬酸雨處理小黑楊幼苗葉片僅PSⅡ電子傳遞供體側(cè)受到抑制，而其他熒光參數(shù)、株高和葉片數(shù)均顯著高于對照。小黑楊對短期內(nèi)酸雨(pH ≥ 4.5)脅迫具有一定的抗性，且適度pH的酸雨有利于小黑楊生長。