侯 靜， 毛金燕, 翟 惠, 王 潔, 尹佟明

(南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

木本植物是生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，在維持碳氧平衡、保護(hù)生物多樣性、涵養(yǎng)水源等方面起著重要作用，同時林木的推廣與利用對于我國綠色經(jīng)濟(jì)建設(shè)也具有重要意義。隨著人民生活水平的提高，對林產(chǎn)品的需求量逐漸增多，對其質(zhì)量的要求也越來越高。林以種為本、種以質(zhì)為先，優(yōu)良種質(zhì)是林業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)和前提。多年來，育種學(xué)家通過雜交育種、誘變育種和多倍體育種等傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行良種選育。由于木本植物具有世代周期長、遺傳負(fù)荷高、基因組倍性復(fù)雜等生物學(xué)特點，良種選育周期很長，盲目性比較大，結(jié)果也不太理想，難以實現(xiàn)快速育種的目標(biāo)[1]。CRISPR/Cas系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的能夠?qū)崿F(xiàn)對基因組進(jìn)行精準(zhǔn)定點編輯的技術(shù)，具有操作簡單、制作成本低、周期短、效率高等優(yōu)點，利用該技術(shù)可以實現(xiàn)基因敲除、插入或替換以及染色體重組[2-3]，還可以對目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控，從而精確引入目標(biāo)性狀[4-5]。目前，CRISPR/Cas技術(shù)已在多種動物、植物以及其他生物中得到了成功應(yīng)用，其中植物包括24科45屬[6]，明顯改善了植物產(chǎn)量、品質(zhì)、抵抗生物和非生物脅迫等性狀，獲得了大量具有優(yōu)良性狀的新品種，實現(xiàn)了種質(zhì)資源的原始創(chuàng)新[7]。筆者對CRISPR/Cas技術(shù)在木本植物中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，分析了存在的問題和未來發(fā)展的趨勢，以期為木本植物基因功能研究及品種改良提供有益參考。

1 生長性狀改良

植物生長的快慢直接決定產(chǎn)量的高低，研究人員通過嘗試不同的方法來提高植物生長速率。生物固氮在提高產(chǎn)量、降低化肥使用量、減少污染等方面具有重要作用。豆科植物是經(jīng)典的生物固氮模式，如何將這種機(jī)制引入非豆科植物建立非豆科植物的固氮新體系是“國際生物學(xué)計劃”的重點研究內(nèi)容。通過不斷研究發(fā)現(xiàn)除了豆科植物，還有一種非豆科植物糙葉山黃麻(Parasponiaandersonii)也可以進(jìn)行生物固氮。糙葉山黃麻是一種快速生長的熱帶大麻科(Cannabaceae)樹種，可作為模式體系進(jìn)行非豆科植物共生固氮研究。通過比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，山黃麻中存在4個在豆科植物中與根瘤菌共生相關(guān)的同源基因(PanHK4、PanEIN2、PanNSP1、PanNSP2)。為了進(jìn)一步確定4個基因在山黃麻中的功能，Zeijl等[8]利用CRISPR/Cas9分別對糙葉山黃麻PanHK4、PanEIN2、PanNSP1、PanNSP2進(jìn)行敲除，雙等位基因突變率為34.5%～66.7%。根據(jù)突變系的性狀表現(xiàn)確定Panhk4與原瘤活性相關(guān)，PanEIN2控制性別分化，PanNSP1和PanNSP2是結(jié)瘤形成的關(guān)鍵基因，極大地推動了非豆科植物共生固氮系統(tǒng)研究進(jìn)展，為共生固氮系統(tǒng)到非豆科植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移提供了理論依據(jù)。

植物光合作用是有機(jī)物合成的主要途徑，主要包括光反應(yīng)和暗反應(yīng)兩個階段，涉及光捕獲、電子傳遞、光合磷酸化、碳同化等重要反應(yīng)步驟。類胡蘿卜素在光捕獲階段扮演著重要的角色，而八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)是類胡蘿卜素合成途徑中的首要限速酶，可以催化八氫番茄紅素從沒有顏色的狀態(tài)轉(zhuǎn)變成有色狀態(tài)的類胡蘿卜素。為了進(jìn)一步驗證PDS基因在光合作用中的功能，2015年Fan等[9]通過CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)了對楊樹中PtoPDS基因的敲除，突變效率達(dá)到51.7%，突變植物具有明顯的白化表型，成功地證明了PDS基因在類胡蘿卜素合成途徑中的重要作用。隨后研究人員利用CRISPR/Cas9敲除技術(shù)在蘋果(Malusspp.)[10]、木薯(Cassavaspp.)[11]、葡萄(Vitisvinifera)[12]等物種中均獲得了具有白化表型的PDS基因突變株。目前，PDS基因已成為檢測植物遺傳轉(zhuǎn)化體系及CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變效率的指示基因。

植物激素影響細(xì)胞的分裂、伸長和分化，對植物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。獨腳金內(nèi)酯是最新發(fā)現(xiàn)的植物激素，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別對歐美雜種葡萄(Vitisviniferacv. Chasselas ×Vitisberlandieri)胚性細(xì)胞中兩個獨腳金內(nèi)酯基因VvCCD7和VvCCD8進(jìn)行敲除，得到的突變系植株產(chǎn)生分枝的數(shù)量明顯多于野生型的分枝數(shù)[13]。除了獨腳金內(nèi)酯，植物體內(nèi)存在自上而下的生長素濃度梯度和自下而上的細(xì)胞分裂素濃度梯度，兩者協(xié)調(diào)作用，維持著植物的正常生長和分枝。這兩種激素之間存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在木本植物中的研究較少，利用CRISPR/Cas技術(shù)有望解析生長素和細(xì)胞分裂素對木本植物生長的調(diào)節(jié)機(jī)制。2017年Finlayson[14]通過對擬南芥(Arabidopsisthaliana)的研究發(fā)現(xiàn)，TCP型轉(zhuǎn)錄因子(BRANCHED1、BRANCHED2)可以通過抑制芽的生長來影響植物的株型，但相比于BRANCHED1，BRANCHED2的作用較小。2018年Muhr等[15]以楊樹(Populusspp.)為研究材料，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)分別對楊樹兩個同源基因BRANCHED1-1和BRANCHED2-1進(jìn)行敲除，兩個基因的敲除突變體不僅增強(qiáng)了芽的生長，還對葉的發(fā)育具有一定影響。另外，與擬南芥相反，BRANCHED2在楊樹中的作用比BRANCHED1大，突變株的表型更加明顯[15]。這一結(jié)果表明同源基因的功能在不同物種中可能相似，但也可以進(jìn)化成不同的特征，特定的基因需要在其所屬物種中進(jìn)行研究，才能明確該基因的功能。

2 材性性狀改良

木本植物的次生生長決定著木材的產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。次生生長是一個復(fù)雜的細(xì)胞分化、發(fā)育過程，包括次生細(xì)胞壁形成、木質(zhì)化(木質(zhì)素沉積)、細(xì)胞程序化死亡(PCD)及心材形成等，這一過程涉及多個轉(zhuǎn)錄因子家族、植物激素及大量的功能基因[16]。由于林木生長周期長、基因整合相對困難，次生生長相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子的研究主要以擬南芥為主，但由于擬南芥是1年生草本植物，沒有真正的次生生長，同時缺少某些木材形成的基因和相關(guān)的生物學(xué)過程，不能全面展示多年生木本植物次生發(fā)育的特點。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)為木本植物基因功能研究提供了平臺。NST/SND在擬南芥中是木質(zhì)部纖維細(xì)胞次生細(xì)胞壁形成的主要調(diào)節(jié)因子。2019年Takata等[17]以山楊(Populusdavidiana)為研究材料對4個與擬南芥直系同源的NST/SND進(jìn)行敲除，驗證其在木本植物中的功能。通過觀察發(fā)現(xiàn)，敲除突變體中木質(zhì)纖維、韌皮部纖維和木質(zhì)部射線薄壁細(xì)胞中的次生細(xì)胞壁較薄，有的細(xì)胞中甚至沒有形成次生細(xì)胞壁，進(jìn)一步證實了NST/SND在木本植物中具有調(diào)控木材纖維、木質(zhì)部射線薄壁細(xì)胞和韌皮部纖維中次生細(xì)胞壁形成的功能。毛白楊(Populustomentosa)中的PtoMYB156是R2R3-MYB的轉(zhuǎn)錄因子，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對PtoMYB156進(jìn)行敲除時，毛白楊突變植株中木質(zhì)素、木聚糖和纖維素在次生細(xì)胞壁形成過程中出現(xiàn)異位沉積，研究結(jié)果表明PtoMYB156對楊樹次生細(xì)胞壁的形成起負(fù)調(diào)控作用[18]。植物4-香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)是苯丙烷衍生物，如類黃酮和木質(zhì)素等合成途徑中的關(guān)鍵酶。楊樹中有兩個4CL基因(4CL1和4CL2)，通過表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)4CL1主要在木質(zhì)部表達(dá)，而4CL2則在幼葉表皮細(xì)胞中表達(dá)。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對楊樹717(Populustremula×albaclone 717-1B4)4CL1基因功能進(jìn)行敲除驗證，觀察并統(tǒng)計4CL1敲除突變株表型發(fā)現(xiàn)其莖桿均呈現(xiàn)紅棕色，而且木質(zhì)素含量降低了23%。木質(zhì)素含量降低會改變木質(zhì)素單酚的含量，進(jìn)而使植株莖桿變色，這一顏色變化可作為木質(zhì)素含量變化的性狀指標(biāo)[19]。目前，利用CRISPR/Cas9技術(shù)雖然對一些木材形成相關(guān)基因的功能進(jìn)行了驗證，但這一過程涉及的基因眾多，要準(zhǔn)確揭示每個基因的功能及它們之間的相互聯(lián)系，通過單個基因和多個基因的突變表型進(jìn)行驗證，需要大量的人力、物力和時間的投入。利用高效便捷的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和高通量的寡核苷酸芯片合成技術(shù)可以大規(guī)模地對木材形成相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行編輯，開展大型突變體庫的創(chuàng)制工作，實現(xiàn)突變體的高通量構(gòu)建和功能篩選，通過所獲得的特定性狀的突變體來確定控制特定性狀的基因，對基因功能作出相應(yīng)分析，進(jìn)而了解所有基因如何協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，完成一系列的次生生長發(fā)育過程，解析木材形成機(jī)制。

3 抗性性狀改良

3.1 抗病性改良

植物病害是影響產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一，目前主要通過化學(xué)方法進(jìn)行防治，但化學(xué)殺菌劑不僅污染環(huán)境，還會誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生抗藥性，破壞生態(tài)平衡，因此植物抗病新品種的選育迫在眉睫。CRISPR/Cas技術(shù)的出現(xiàn)為優(yōu)良品種的選育開辟了一條嶄新的途徑。柑橘(Citrusreticulata)潰瘍病是由柑橘黃單胞菌柑橘亞種(Xanthomonascitrissp.citri，簡稱Xcc)引起的破壞性極強(qiáng)的柑橘細(xì)菌性病害。Xcc主要通過氣孔和微傷口進(jìn)入植物內(nèi)部，造成果實、葉片和莖產(chǎn)生壞死性潰瘍病斑，感病嚴(yán)重時會導(dǎo)致枝葉枯萎、落葉、落果等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了柑橘的品質(zhì)和產(chǎn)量，給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[20]。通過研究發(fā)現(xiàn)PthA4和CsLOB與柑橘潰瘍病的發(fā)生有關(guān)，PthA4是一類轉(zhuǎn)錄激活類效應(yīng)因子，CsLOB1隸屬于LBD(lateral organ bourdries domain)家族，是植物體內(nèi)易感基因。PthA4可以靶向CsLOB啟動子中的效應(yīng)因子結(jié)合位點，誘導(dǎo)CsLOB基因的表達(dá)，導(dǎo)致柑橘潰瘍癥狀發(fā)生。2017年Jia等[21]利用CRISPR/Cas9對柚子(Citrusmaxima)的CsLOB基因進(jìn)行編輯，得到了6個轉(zhuǎn)基因株系，編輯效率為23.80%～89.36%，由于每個株系CsLOB基因突變位置對功能的影響不同，導(dǎo)致不同的突變系對潰瘍病的抗性也不同。因此在設(shè)計sgRNA時，需盡量靠近基因編碼區(qū)的ATG下游，最好位于第1或第2個外顯子，通過移碼突變造成基因功能的缺失，提高突變效率，得到更多的陽性克隆，便于后期的篩選和鑒定。CsLOB啟動子是PthA4的結(jié)合位點，隨后Peng等[22]通過CRISPR/Cas9技術(shù)對柑橘中CsLOB1基因的啟動子序列進(jìn)行敲除，突變植物對柑橘潰瘍病的抗性明顯增強(qiáng)，有的突變系甚至可以完全抵抗Xcc的入侵。通過測序分析發(fā)現(xiàn)，突變植株的抗性強(qiáng)度與CsLOB1基因啟動子的突變率有關(guān)，雙等位基因突變體或純合突變體抗性最強(qiáng)，但僅占5.3%，絕大部分突變體為嵌合體，比例高達(dá)73.7%。另外，在柑橘基因組中檢測到了205個脫靶位點。因此，對CRISPR/Cas9體系需要進(jìn)一步改善來降低嵌合體和脫靶現(xiàn)象的產(chǎn)生。CRISPR-Cas12a是最新興起的基因組編輯技術(shù)，是CRISPR-Cas9的互補(bǔ)系統(tǒng)。利用CRISPR-Cas12a編輯柚子CsLOB1基因的啟動子序列，突變株系也表現(xiàn)出對柑橘潰瘍病具有較高的抗性。與CRISPR-Cas9編輯相比，兩個系統(tǒng)造成堿基丟失的數(shù)目相似，但CRISPR-Cas12a雙等位基因突變體的概率更低，僅為5%[23]。雖然CRISPR-Cas12a在柚子抗病性研究中有一定前景，但編輯效率的提高是今后應(yīng)用的前提。

疫霉菌是一群重要的植物病原菌，寄主范圍很廣，包括林木、蔬菜、花卉、中草藥材等上萬種植物。疫病破壞性極強(qiáng)，危害性較大，常見癥狀有葉斑、枝枯、果腐、根腐、心腐、莖潰瘍及其他營養(yǎng)器官的腐爛等，嚴(yán)重時導(dǎo)致全株死亡，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，世界各國的學(xué)者對疫霉菌的致病性及其所致病害的控制方面進(jìn)行了大量研究[24]?？煽蓸?Theobromacacao)作為生產(chǎn)可可豆的熱帶樹木，是數(shù)十億美元巧克力產(chǎn)業(yè)的中心。疫霉菌對可可樹的侵害可以摧毀一個農(nóng)場上所有的可可豆。為了提高可可樹對疫病的抗性，研究人員對可可免疫反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了廣泛探索，找到了一些可可病原體受體基因和下游途徑的其他組分，其中NPR3為水楊酸結(jié)合蛋白，抑制病原體防御反應(yīng)[25]。Fister等[26]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化在可可樹葉片組織中引入CRISPR/Cas9系統(tǒng)對TcNPR3進(jìn)行敲除，敲除率達(dá)27%。通過對瞬時轉(zhuǎn)化的組織進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)，可可基因組只有TcNPR3基因發(fā)生了編輯，沒有出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。TcNPR3突變后的組織對疫霉菌感染的抗性增強(qiáng)，下游防御基因的表達(dá)量也有所升高。這一研究表明使用高效且特異的sgRNA不僅可以提高CRISPR/Cas9的基因組編輯效率，還可以降低脫靶風(fēng)險，因此，sgRNA是基因組編輯成功與否的關(guān)鍵性因素之一。

灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的可危害果樹、花卉、蔬菜等多種植物的重要病害。長期以來，灰霉病的防治主要依賴多菌靈、速克靈等化學(xué)藥劑，但由于病菌抗藥性迅速產(chǎn)生，其防治效率大大下降[27]。隨著CRISPR技術(shù)的發(fā)展，大量研究人員開始利用此技術(shù)培育抗病新品種。WRKY蛋白是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，共有74個成員。病原菌、傷害以及植物激素類物質(zhì)等多種外界因素均能誘導(dǎo)WRKY基因的表達(dá)，在生物和非生物逆境激發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用[28]。Wang等[29]設(shè)計了4個sgRNA用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對湯普森無核葡萄(Thompson Seedless)基因組中VvWRKY52轉(zhuǎn)錄因子基因的敲除，獲得了22個突變植株，其中15個株系為雙等位基因突變，7個株系為雜合突變，共有72個T-DNA插入突變，沒有出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。為了確定VvWRKY52在生物脅迫中的作用，將灰葡萄孢接種在突變株與野生型植株上，表型觀察結(jié)果顯示這些T0代轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出對灰霉病的抗性。通過對不同突變株系中目標(biāo)序列的GC含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)50%～70%的GC含量通常會導(dǎo)致較高的編輯效率，因此，在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯時需要考慮目標(biāo)序列GC含量對編輯效率的影響[29]。

白粉病是真菌性病害，菌種種類繁多。該病主要危害植株的葉片，嚴(yán)重時對植株的幼芽、嫩梢、花蕾、幼果等部位也會產(chǎn)生危害，造成植株落葉、頂芽枯死、新梢干枯、花芽不能形成、樹勢衰弱、生長停滯、產(chǎn)量大減。葡萄白粉病由葡萄鉤絲殼菌(Uncinulanecator)侵染所致，是危害葡萄生產(chǎn)業(yè)的主要病害，在全國各地幾乎都有分布，給果農(nóng)造成了巨大損失，為此，大量學(xué)者開展葡葡白粉病的防治工作。通過對葡萄抗病機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)葡萄基因組中存在易感基因MLO-7[30]，以前研究中利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)降低葡萄VvMLO7基因的表達(dá)量，增強(qiáng)了葡萄對白粉病的抗性，感染率下降了77%[31]。由于RNAi技術(shù)的高脫靶性，使其很難實現(xiàn)新品種創(chuàng)制。為了繁育葡萄抗白粉病商業(yè)品種，Malnoy等[32]于2016年利用DNA-free技術(shù)將純化的CRISPR/Cas9核糖核酸蛋白和sgRNAs直接轉(zhuǎn)入霞多麗葡萄(Chardonnay)的原生質(zhì)體中對MLO-7進(jìn)行突變。結(jié)果表明， Cas9與sgRNA含量比為3∶1時MLO-7基因的突變效率最高，而且沒有產(chǎn)生額外的遺傳修飾。這一過程不涉及任何外源DNA，在葡萄中建立了全程DNA-free基因編輯系統(tǒng)，使基因編輯植物與傳統(tǒng)植物一樣安全，此技術(shù)對于推動基因編輯植物的商業(yè)化利用具有重要意義。

木薯褐條病(CBSD)是由木薯褐條病毒(CBSV)和烏干達(dá)木薯褐條病毒(UCBSV)兩種RNA病毒引起的，這兩種病毒屬于馬鈴薯Y病毒家族。該病害會導(dǎo)致木薯葉脈出現(xiàn)羽狀缺綠，塊根上出現(xiàn)黃色或褐色的軟木狀枯斑，嚴(yán)重影響木薯產(chǎn)量。研究表明，病毒基因組連接蛋白(VPg)需要與木薯翻譯起始因子4E(eIF4E)亞型中的ncbp-1和ncbp-2進(jìn)行相互作用才能引起褐條病毒的致病性。美國科研人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對木薯品種60444基因組中的ncbp-1和ncbp-2進(jìn)行編輯，獲得了ncbp-1、ncbp-2和ncbp-1/ncbp-2突變體。將突變型植株和野生型植株同時接種木薯褐條病毒，通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，ncbp-1/ncbp-2雙突變植株的木薯褐條病的發(fā)病率明顯降低，病害癥狀明顯較弱。對獲得的所有植物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，91%的突變系在目標(biāo)位點攜帶indels，其中純合和雙等位突變占78%。CRISPR/Cas9技術(shù)在木薯基因組中不僅實現(xiàn)了雙基因突變，還獲得了較高的編輯效率[33]。

3.2 抗旱性改良

干旱是因植物根部對葉片水分供應(yīng)減少導(dǎo)致葉片水勢以及膨壓降低，嚴(yán)重影響植物正常生理功能和代謝機(jī)能，使生長受到抑制，甚至?xí)鸩糠只蛘哒晁劳?。?jù)統(tǒng)計，全世界由于水分脅迫導(dǎo)致的作物減產(chǎn)可超過其他因素造成減產(chǎn)的總和，是世界上最為嚴(yán)重的災(zāi)害之一。我國52.5%的國土面積為干旱和半干旱地區(qū)，其中半干旱地區(qū)人工造林成活率、保存率僅為30%，而干旱地區(qū)僅為4%，最高不足20%，嚴(yán)重阻礙了林業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展以及生態(tài)環(huán)境的改善[34]。楊樹廣泛分布于北半球，是我國重要的工業(yè)用材林和生態(tài)防護(hù)林樹種，具有生長快、成材早、產(chǎn)量高等特點，但對干旱環(huán)境較為敏感，因此，耐旱基因型楊樹的培育會進(jìn)一步提高楊樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。林木在生長過程中，根系負(fù)責(zé)對水分和養(yǎng)分的吸收，木質(zhì)部導(dǎo)管負(fù)責(zé)將水分養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)街仓甑母鱾€部分。當(dāng)植株受到干旱脅迫時，會通過兩種機(jī)制確保植株逃逸干旱和耐受干旱。逃逸機(jī)制是通過增加根系生長促進(jìn)植物對水分的吸收[35]。研究表明，擬南芥通過NF-YB2和NF-YC2與ABA響應(yīng)元件進(jìn)行互作來提高其對環(huán)境脅迫的抵抗能力。為了了解NF-Y在楊樹逆境脅迫響應(yīng)中的作用，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)獲得了pdnf-yb21突變體材料，通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體的根系生長明顯減弱，抗旱水平也明顯下降，揭示了NF-Y轉(zhuǎn)錄因子在楊樹抗旱中的功能[36]。當(dāng)植物處于重度干旱的條件下，植物開始調(diào)節(jié)自身避免組織細(xì)胞死亡。此時，木質(zhì)部細(xì)胞迅速感知干旱信號并將信號進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活bZIP類轉(zhuǎn)錄因子AREB/ABF，AREB/ABF通過與組蛋白乙?；?GCN5)和轉(zhuǎn)錄共激活因子(ADA2)相互作用形成AREB-ADA2-GCN5蛋白復(fù)合體，與ABA應(yīng)答基因的順式作用元件ABRE進(jìn)行結(jié)合，介導(dǎo)組蛋白3第9位賴氨酸的乙?；?H3K9ac)修飾富集，誘導(dǎo)并促進(jìn)ABA依賴基因的表達(dá)，最終提高植物對干旱脅迫的抵抗能力和耐受性。2019年Li等[37]以干旱條件下生長的毛果楊為研究材料，對其木質(zhì)部進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀測序(ChIP-seq)繪制H3K9ac圖譜，再結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)發(fā)現(xiàn)有76個含有ABRE元件的基因的啟動子被H3K9ac修飾。他們采用RNA干擾技術(shù)對PtrAREB1-2、PtrGCN5-1的表達(dá)進(jìn)行抑制，并通過CRISPR/Cas9技術(shù)對PtrADA2b-3進(jìn)行敲除，3個基因突變植株的耐旱性均表現(xiàn)出明顯降低，而且H3K9ac修飾和PtrNAC的轉(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)了顯著下降，結(jié)果表明PtrAREB1-2、PtrADA2b-3和PtrGCN5-1均是激活楊樹耐旱效應(yīng)基因所必需的。由此可見，CRISPR/Cas9技術(shù)加速了楊樹基因功能的研究進(jìn)展，為林木抗旱分子育種技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。

4 問題與展望

木本植物具有世代周期長、遺傳負(fù)荷高、基因組倍性復(fù)雜等生物學(xué)特點，利用傳統(tǒng)育種方法選育良種時，周期很長、盲目性大，結(jié)果也不太理想，難以實現(xiàn)快速育種的目標(biāo)。CRISPR系統(tǒng)以其操作簡單、高效等優(yōu)點，成為了繼鋅指核酸酶(ZFNs)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)技術(shù)以來第3代定點編輯技術(shù)。利用CRISPR系統(tǒng)對木本植物基因組進(jìn)行編輯，實現(xiàn)物種的原始創(chuàng)新，將大大加快木本植物的育種進(jìn)程。但由于多數(shù)木本植物尚未建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，限制了CRISPR系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用。目前僅在楊樹、山黃麻、木薯、柑橘、葡萄等少數(shù)物種中通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)完成了靶標(biāo)基因的定點突變，造成基因功能缺失，實現(xiàn)了相關(guān)基因功能驗證，也獲得了一些在生長、材性、抗性性狀上得到改良的突變系。但CRISPR/Cas9系統(tǒng)在應(yīng)用過程中也出現(xiàn)了一些問題，如：①脫靶效應(yīng)，使基因組非靶向位點發(fā)生突變，降低了植物表型性狀的可信性；②編輯效率普遍偏低，而且不同靶基因喪失功能的效率差異明顯；③雙等位基因突變體或純合突變體少，絕大部分突變體為嵌合體。這些問題不僅與CRISPR/Cas9系統(tǒng)有關(guān)，也與木本植物基因組的特殊性相關(guān)。木本植物基因組大多經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件，導(dǎo)致基因組內(nèi)存在大量的重復(fù)序列[38]，這些重復(fù)序列的存在會使sgRNA靶向多個序列，出現(xiàn)脫靶突變。另外，木本植物基因組的雜合度較高，等位基因間往往存在序列多態(tài)性，但目前這些已公布的基因組序列并沒有等位基因的序列信息，當(dāng)以其作為參考基因組設(shè)計sgRNA時，很可能會出現(xiàn)sgRNA靶向等位基因中的一個基因，導(dǎo)致嵌合體的產(chǎn)生。因此，高質(zhì)量的基因組信息是提高CRISPR編輯效率并減少脫靶效應(yīng)的重要因素，能夠有效地對高雜合基因組生成高質(zhì)量的單倍型基因組將會顯著提高T0代雙等位基因突變株或純合突變株的比例。

如今，CRISPR已經(jīng)發(fā)展成為以CRISPR/Cas9[39]、CRISPR/Cas12[40]、CRISPR/Cas13[41]和CRISPR/Cas14[42]為主的4大編輯系統(tǒng)。CRISPR/Cas12識別富含T的PAM序列，是CRISPR/Cas9的互補(bǔ)系統(tǒng)，這一系統(tǒng)只在柚子中得到了應(yīng)用，獲得的突變系表現(xiàn)出對柑橘潰瘍病的抗性[23]。在今后的研究中應(yīng)根據(jù)靶基因的PAM序列選擇相應(yīng)的編輯系統(tǒng)，提高木本植物基因編輯效率。另外，sgRNA可以同時靶向多個基因，甚至整個基因組序列，實現(xiàn)多基因同時敲除、全基因組突變體庫構(gòu)建，可進(jìn)行木本植物冗余基因功能研究、基因調(diào)控研究及遺傳育種[43-44]。木本植物還有很多性狀是需要獲得基因功能，如：植物的耐旱性，因此，利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系統(tǒng)進(jìn)行堿基替換或插入目的基因可實現(xiàn)基因的定向進(jìn)化。該技術(shù)已成功應(yīng)用在水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)[45]、西瓜(Citrulluslanatus)[46]、棉花(Gossypiumspp.)[47]等草本植物基因突變體的創(chuàng)制，均獲得了堿基編輯新品種。目前，高彩霞研究組和李家洋研究組對Cas9進(jìn)行了改造，構(gòu)建了新型的飽和靶向內(nèi)源基因突變堿基編輯器(STEME)，以水稻原生質(zhì)體為材料進(jìn)行編輯，結(jié)果顯示一個sgRNA引導(dǎo)可以誘導(dǎo)靶位點C>T和A>G的同時突變， C>T突變效率高達(dá)61.61%，C>T和A>G同時發(fā)生突變的效率也高達(dá)15.50%，顯著增加了靶基因堿基突變的飽和度及產(chǎn)生突變類型的多樣性[48]。推進(jìn)這一技術(shù)在木本植物中的應(yīng)用，實現(xiàn)定向修正堿基突變和創(chuàng)制核苷酸變異，將加快木本植物基因功能獲得性突變體的創(chuàng)制。雖然CRISPR系統(tǒng)為創(chuàng)建理想的突變體材料提供了可能，但該技術(shù)需要攜帶Cas9/Cas12-gRNA及轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記的表達(dá)元件通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)入植物材料中，并整合到基因組上。由于木本植物營養(yǎng)生長周期較長，很難從突變系的后代中分離DNA-free和marker-free的基因編輯新品種，這將影響品種的審定與推廣[49]。因此，建立全程DNA-free植物基因組編輯系統(tǒng)對于推動基因編輯植物的商業(yè)化利用具有重要意義。Malnoy等[32]利用DNA-free技術(shù)在葡萄的原生質(zhì)體中對MLO-7基因進(jìn)行了敲除，但效率極低，僅為0.1%，影響了該技術(shù)在木本植物中的應(yīng)用。李正和教授研究組利用植物負(fù)鏈RNA彈狀病毒載體向煙草葉片遞送CRISPR/Cas9核酸內(nèi)切酶，可有效形成系統(tǒng)侵染并表達(dá)Cas9/gRNA分子，對獲得的再生植物進(jìn)行基因分型，結(jié)果表明超過90%的植株含有靶向突變，其中純和突變的概率高達(dá)57%[50]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了葡萄原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率，該研究為木本植物DNA-free基因組編輯的應(yīng)用提供了新的思路。隨著CRISPR技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，延伸了其在諸多研究中的應(yīng)用，CRISPR/Cas13可以對RNA進(jìn)行敲除及堿基替換，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控及RNA病毒的檢測和捕殺[41]，CRISPR/Cas14可以對ssDNA病毒進(jìn)行檢測、捕殺及高保真SNP(single-nucleotide polymorphisms)基因分型[42]。還有一些基因組編輯的衍生技術(shù)，如dCas蛋白與不同功能蛋白形成的融合蛋白系統(tǒng)可進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、熒光成像等研究[51]，但這些研究在木本植物中的應(yīng)用尚屬空白，拓寬這些新技術(shù)在木本植物上的應(yīng)用將會進(jìn)一步加快木本植物基因功能研究及品種改良進(jìn)程。