湯華，陳少軍，韓晶，夏開來，姜萊，鄭剛

顱內(nèi)動脈瘤破裂后蛛網(wǎng)膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH）引起的腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）是影響患者預后的關鍵因素之一，其發(fā)病機制主要是各種原因引起的血管平滑肌收縮[1]。研究表明，來源于細胞膜鞘脂類和甘油磷脂的1- 磷酸神經(jīng)鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）和 溶 血 磷 脂 酸（lysophosphatidic acid，LPA）等脂質(zhì)介質(zhì)，維持著血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的正常功能和成熟分化[2-4]。Coussin等[5]發(fā)現(xiàn)S1P可引起腦動脈收縮。本研究通過分析aSAH 患者CVS 的程度與腦脊液及血清S1P 水平的關系，探討S1P 與aSAH 后CVS 的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016 年7 月至2019 年9 月我院神經(jīng)外科收治的自發(fā)性SAH患者37例，其中27例行DSA檢查證實至少有1～2個分段血管痙攣，納入痙攣組；另有10 例DSA 檢查未發(fā)現(xiàn)CVS，納入無痙攣組。納入標準：均經(jīng)頭顱CT 或腰穿證實為aSAH，且入院24 h內(nèi)行DSA檢查確診顱內(nèi)動脈瘤，并同時成功行顱內(nèi)動脈瘤介入栓塞治療；意識障礙較輕，無明顯或僅有輕度局灶性神經(jīng)功能障礙，Hunt-Hess 分級Ⅰ～Ⅲ級。排除標準：外傷性或病因不明性等非動脈瘤破裂所致的SAH；病情危重，Hunt-Hess 分級Ⅳ～Ⅴ級；具有嚴重的并發(fā)癥或其他系統(tǒng)疾??；既往有相關血管病史（頸內(nèi)動脈狹窄、煙霧病等）；已納入無痙攣組患者，在TCD跟蹤檢測期間血流速度＞120 cm/s，復測一次仍增高。另在同時期我院未破裂顱內(nèi)動脈瘤介入栓塞治愈術后半年復診患者中，選取入院DSA 檢查未見血管痙攣及血管狹窄的患者12例為對照組，納入標準：均為單純彈簧圈栓塞，未放入支架，術后未行阿司匹林和氯吡格雷抗凝抗聚治療。對照組12 例，男7 例，女5 例；平均年齡（62.5±10.3）歲；吸煙25.0%，飲酒16.7%；糖尿病33.3%，高血壓66.7%，高脂血癥16.7%。無痙攣組10 例，男6 例，女4 例；平均年齡（63.2±9.8）歲；吸煙20.0%，飲酒10.0%；糖尿病30.0%，高血壓70.0%，高脂血癥10.0%。痙攣組27 例，男16 例，女11 例；平均年齡（61.3±8.9）歲；吸煙18.5%，飲酒14.8%；糖尿病22.2%，高血壓77.8%，高脂血癥11.1%。3組一般資料差異均無統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。本研究通過倫理學審批，受試者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 所有患者均給予對癥治療。痙攣組及無痙攣組患者入院后均給予靜脈輸注尼莫地平治療：每劑25 mg，速度0.5 μg/(kg·min)，監(jiān)測血壓，以血壓不下降或略有下降為宜，2 周后改口服，每次30～60 mg，每日3次，口服1周。對照組不使用尼莫地平等抗血管痙攣藥物。

1.2.2 血清及腦脊液中S1P 的高效液相色譜法測定 S1P 標準品和2,3-萘二甲醛（NDA）購自美國Sigma 公司，甲醇等其他有機試劑購自中國國藥集團公司。25 μL 血清加入150 μL 氯仿∶甲醇（1∶2，V/V）后超聲5 min；然后加入100 μL 1 mmol/LNaCl、100 μL 氯仿、10 μL 濃鹽酸后離心（13 000g，2 min）取有機相（萃取2 次）蒸干得到脂質(zhì)結(jié)晶，以25 μL乙醇溶解。10 μL樣本加入20 μL NDA衍生混合物（25 mmol/L 硼酸鹽緩沖液，pH9.0；2.5 mmol/L NDA；2.5 mmol/L NaCN），50℃水浴10 min；加入3倍體積的無水乙醇稀釋，室溫離心（13 000g，5 min），最后以C18色譜柱（Phenomenex公司，美國）和高效液相色譜儀（AVRIAN240，美國）分析。色譜條件：流動相采用梯度法，根據(jù)出峰時間定性，標準曲線定量。標準品按上述方法進行HPLC后以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 血管痙攣判定 所有患者在診斷性DSA檢查確診后，尚未行介入栓塞前，利用DSA 機電腦軟件依次測定大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）M1、M2 段血管直徑。對照組患者采用同樣方法測定相應血管的直徑，并取平均值做參考標準。按照Weidauer[6]推薦的判定標準，確認是否有血管痙攣：血管直徑縮小比例＜10%為無血管痙攣；血管直徑縮小比例≥11%可判定為血管痙攣?；颊甙l(fā)病后第3、5、7、10、14天分別行TCD檢測，跟蹤血管痙攣變化。國內(nèi)外標準選MCA（M1段、M2段）為最佳測試血管段，根據(jù)雙側(cè)MCA腦血流平均速度分類，＜120 cm/s 無痙攣，120～140 cm/s 為輕度痙攣；140～200 cm/s 為中度痙攣；＞200 cm/s 為重度痙攣。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（均數(shù)±標準差）表示，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較使用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率（百分比）表示，χ2檢驗；Person相關性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MCA血流速度比較

TCD結(jié)果顯示，在發(fā)病后第3、5、7、10天，痙攣組的MCA血流速度高于無痙攣組，見圖1A；與對照組相比，發(fā)病后第7天痙攣組的MCA 血流速度顯著增高（P＜0.01），但無痙攣組則無顯著改變，見圖1B。其中痙攣組的MCA 血流速度在第3 天已顯著高于無痙攣組（P=0.003），第5 天呈進行性升高趨勢（P=0.002），第7 天達到峰值（P=0.001），第10 天呈下降趨勢但仍高于無痙攣組（P=0.022），第14 天下降至與無痙攣組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.079）。

圖1 TCD測定各組MCA血流速度

2.2 各組腦脊液與血清中的S1P水平比較

以S1P 標準品配制濃度梯度的標準品溶液，通過HPLC 法檢測的結(jié)果表明濃度在0.1～1.6 nmol/L 內(nèi)S1P 的濃度與峰面積具有良好的線性關系，相關系數(shù)為0.995，見圖2A。與無痙攣組相比，痙攣組發(fā)病后3 d患者腦脊液和血清中S1P的含量升高，痙攣組發(fā)病后5 d和7 d腦脊液和血清中S1P含量顯著高于無痙攣組（P＜0.01），于第10 天時下降，但仍高于無痙攣組（P＜0.05），至第14天時2組對比差異則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2B、圖2C、表2。與對照組相比，痙攣組發(fā)病后7 d 腦脊液和血清中S1P含量顯著升高（P＜0.01），無痙攣組差異則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2D、圖2E。

圖2 HPLC檢測3組腦脊液和血清中S1P水平的比較

2.3 痙攣組患者MCA血流速度與血清、腦脊液S1P含量的相關性分析

痙攣組aSAH 患者在發(fā)病后第7 天的MCA 血流速度與血清和腦脊液的S1P含量均呈正相關（P＜0.05），見圖3。

圖3 痙攣組患者發(fā)病后第7天MCA血流速度與血清（A）及腦脊液（B）中S1P含量的相關性分析

3 討論

CVS導致嚴重的腦組織缺血是aSAH致死和重殘的主要因素[7]。因而防治aSAH 后的CVS 成為臨床aSAH 治療的核心問題。S1P是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要生理功能的一種膜磷脂類分解和代謝產(chǎn)物，其既可作為一種細胞內(nèi)第二信使，又可作用于細胞表面特定的受體分子而發(fā)揮其重要的生物學功能[8,9]。S1P由鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）和鞘氨醇激酶2（sphingosine kinase 2，SphK2）催化鞘氨醇生成，S1P作為G蛋白耦聯(lián)受體家族的一員，是一種高效的脂質(zhì)介質(zhì)，能在多種生理和病理活動中作為第二信使傳導細胞內(nèi)信號。研究人員在血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞都發(fā)現(xiàn)了S1P受體[10]。S1P和鞘氨醇的刺激可導致鈣離子釋放，而在細胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中則無此效應。由于鈣離子的釋放不是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的通透性改變，而是同非三磷酸肌醇有關，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是磷脂刺激敏感性鈣池的主要位置，同時也是鞘氨醇激酶合成S1P的地點[11]。

表1 aSAH患者各時間點血清和腦脊液的S1P含量（nmol/mL，±s）

表1 aSAH患者各時間點血清和腦脊液的S1P含量（nmol/mL，±s）

注：與無痙攣組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別無痙攣組痙攣組t值P值血清3 d 240.75±53.42 470.22±103.97①2.392 0.041 5 d 303.91±78.11 586.69±127.44②5.851 0.007 7 d 289.75±55.53 523.16±115.68②6.724 0.003 10 d 274.24±46.18 407.24±90.68①3.523 0.04 14 d 308.12±48.91 331.66±91.23 0.157 0.854組別無痙攣組痙攣組t值P值例數(shù)10 27腦脊液3 d 200.35±62.33 310.22±82.17 1.107 0.075 5 d 194.23±61.91 420.99±103.41②6.125 0.009 7 d 219.77±67.87 493.21±110.36②6.53 0.008 10 d 174.33±43.18 360.35±94.75①3.196 0.028 14 d 187.12±48.91 271.65±66.34 1.047 0.127

Coussin 等[5]發(fā)現(xiàn)S1P 可引起腦動脈收縮，但對主動脈無效。研究發(fā)現(xiàn)，腦動脈平滑肌細胞中S1P3/EDG-3 和S1P2/EDG-5 的受體表達水平是主動脈平滑肌細胞的4 倍，而兩者之間S1P受體的表達沒有區(qū)別[12]。提示S1P可能通過其受體在不同系統(tǒng)中表達的類型和數(shù)量的不同，來實現(xiàn)不同的生理功能。Muraki 等[13]研究發(fā)現(xiàn)S1P 作用于兔、小鼠大動脈則不會出現(xiàn)鈣離子水平增高的現(xiàn)象，但是兔的腦部大血管在S1P 作用下會發(fā)生鈣離子水平增高。這表明，不同的血管平滑肌細胞對S1P 的反應有差異性。筆者前期在兔aSAH動物模型發(fā)現(xiàn)，aSAH后第3～5 天，基底動脈可高表達SIP 磷酸酶，使得S1P 的合成明顯增加。兔aSAH動物模型血清及腦脊液中S1P表達的曲線變化趨勢與基底動脈S1P的濃度及血管橫截面積管徑的變化一致[14]。

本研究通過動態(tài)檢測aSAH后CVS患者、aSAH無痙攣患者腦脊液與血清S1P的表達水平，并同步動態(tài)檢測MCA血流速度來變相監(jiān)測血管痙攣程度的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)aSAH 后CVS 患者腦脊液S1P表達明顯高于aSAH無痙攣患者，aSAH后CVS患者腦脊液S1P 升高幅度與其血管痙攣程度呈正相關，與Pulcrano-Nicolas等[15]報道一致。

本研究揭示了S1P 表達與aSAH 后腦血管痙攣的關系，為臨床干預aSAH 后CVS 提供新的潛在治療靶點和研究思路，S1P有望成為臨床預測CVS嚴重程度的一個新指標。此外，本研究也存在一定的局限性，主要是納入病例數(shù)較少，而對于S1P參與aSAH后CVS的具體機制尚未闡明，還需要進一步研究。