朱才民，李旎，邵國(guó)豐

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是一類(lèi)以肺血管阻力進(jìn)行性升高并伴隨著肺血管重塑為特點(diǎn)的少見(jiàn)并且致命性的疾病，其病理生理特征是由增殖的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成的肺小動(dòng)脈叢狀病變引起的閉塞性血管病變，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高，并且最高致使右心功能衰竭和死亡[1]。PAH分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（PPH）是目前原因不明的一類(lèi)肺動(dòng)脈高壓，屬致命性PAH，臨床較少見(jiàn)，包括特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（IPAH）與家族性肺動(dòng)脈高壓（FPAH）。繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓可發(fā)生于重癥慢性肺部疾病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、先天性心臟病、心臟瓣膜病、風(fēng)濕性心臟病及艾滋病等，除有肺動(dòng)脈高壓的臨床表現(xiàn)外，還有原發(fā)病所呈現(xiàn)的表現(xiàn)[2]。研究顯示高度增殖的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）中SOD2基因的表達(dá)水平下降，會(huì)引發(fā)氧化還原反應(yīng)信號(hào)通路受損，且SOD2表達(dá)水平的下降主要是由于DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶調(diào)控的SOD2啟動(dòng)子區(qū)域CpG島DNA甲基化，引起SOD2基因轉(zhuǎn)錄抑制所致[3]。本研究旨在探討PAH致病B型腦利鈉肽（BNP）基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的DNA甲基化水平表達(dá)變化與PAH患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，為PAH提供新一輪的治療方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017—2018年期間于寧波市李惠利醫(yī)院治療的風(fēng)濕性心臟病合并PAH的患者60例為實(shí)驗(yàn)組。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）先天性心臟病、梅毒性心瓣膜病、感染性心內(nèi)膜炎、乳頭肌功能不全、腱索斷裂及粘液樣變性等所致的瓣膜損害；（2）精神疾病、聽(tīng)力障礙或語(yǔ)言表達(dá)交流障礙；（3）合并基礎(chǔ)疾病，其他出血凝血疾病史，惡性腫瘤史；（4）孕產(chǎn)婦，HIV感染者。根據(jù)肺動(dòng)脈壓力（PASP）分為輕度PAH（30 mmHg≤PASP＜50 mmHg，1 mmHg≈0.133 kPa）、中度PAH（50 mmHg≤PASP＜70 mmHg）及重度PAH（PASP≥70 mmHg）[4]3組，各20例。輕度組男10例，女10例；中位年齡50歲。中度組男10例，女01例；中位年齡48歲。重度組男10例，女10例；中位年齡53歲。另選取同期心肺功能正常的健康體檢者20例為對(duì)照組，男10例，女10例。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的同意簽署書(shū)面同意書(shū)。

1.2 試劑及儀器 基因組DNA抽提試劑盒（QIAGEN 51104），甲基化修飾試劑盒（QIAGEN），dNTP、TBE、6*Loading buffer購(gòu)于上海捷蘭生物技術(shù)有限公司，Taq酶（KAPA），臺(tái)式高速離心機(jī)PICO 17、NANO-DROP（Thermo），BIORADPOWERPAC 3000、BIO RAD DNA SUB CELL（BIO RAD），凝膠成像系統(tǒng)GIS-1600購(gòu)于上海天能科技有限公司，ABI 9700 PCR System（Applied Biosystems），Pyro-Mark Q96 ID（PyroMark Q96 ID）。

1.3 方法 提取血漿中DNA后利用亞硫酸鹽修飾反應(yīng)進(jìn)行甲基化修飾，再進(jìn)一步純化亞硫酸鹽修飾的DNA，進(jìn)行甲基化PCR，最后進(jìn)行Pyrosequencing檢測(cè)。其中引物合成由PyroMark Assay Design 2.0設(shè)計(jì)，由華大基因合成。見(jiàn)表1。

表1 BNP引物

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

以PAH患者與正常對(duì)照組為研究對(duì)象，選取了5個(gè)位點(diǎn)，測(cè)定每個(gè)位點(diǎn)CpG島（pos.1～5）甲基化狀態(tài)。每個(gè)位點(diǎn)甲基化率見(jiàn)封三彩圖1。PAH組在pos.2、pos.4、pos.5位點(diǎn)與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。通過(guò)比較輕、中和重度PAH與對(duì)照組，中度、重度PAH組pos.4位點(diǎn)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)封三彩圖2。

3 討論

BNP廣泛分布于心、肺、腦、脊髓等組織，但是在心臟中含量最高，故又稱(chēng)其為心臟類(lèi)激素。人類(lèi)合成BNP的基因片段坐落于1號(hào)染色體的短臂上，與上游的心房利鈉肽（ANP）基因片段相連接，在ANP基因上游長(zhǎng)度約為8kb的位置處，其中有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子參與BNP的基因前體的編碼，在轉(zhuǎn)錄成信使RNA（mRNA）時(shí)去除了2個(gè)內(nèi)含子從而形成編碼134肽的成熟mRNA，翻譯后形成前腦利鈉肽（pre-BNP）。前腦利鈉肽在其分泌的過(guò)程中通過(guò)剪切去除信號(hào)肽后形成pre-BNP，這一過(guò)程是在心臟內(nèi)前體剪切的，形成包含32個(gè)氨基酸殘基的成熟BNP及76個(gè)氨基酸殘基的成熟N端片段（NT-pro-BNP）。BNP主要表達(dá)作用于心室，然心室中BNP含量?jī)H是心房的1%～2%，心室（特別是病理狀態(tài)下的心室細(xì)胞）是合成和分泌BNP的主要位置，而心房細(xì)胞發(fā)揮重要的儲(chǔ)藏作用。BNP在血管內(nèi)發(fā)揮的作用主要是抑制平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，從而在血管再重塑中和調(diào)節(jié)血壓的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，與ANP相比，BNP是一個(gè)更好的反應(yīng)心衰及左心室功能障礙標(biāo)記物，因心肌擴(kuò)張，BNP快速合成釋放于血液中可以幫助調(diào)節(jié)心臟功能[5-6]。另外，BNP還有利鈉利尿，抗醛固酮作用以及舒張血管和降低血壓的作用。在心血管疾病中，諸如充血性心力衰竭、高血壓、急性心肌梗死、心肌病和心肌肥厚等，BNP基因的表達(dá)及合成分泌較正常情況下均顯著增加。在一些研究顯示，血清中BNP的水平與中度PAH患者的平均肺動(dòng)脈壓力呈正相關(guān)，其中敏感性及特異性均比較高[7]。Leuchte[8]和Goetze[9]等的研究顯示，血清BNP水平可用作一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)的簡(jiǎn)便可靠并且穩(wěn)定的指標(biāo)從而對(duì)肺部疾病中PAH的程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，并可以反映中度以上的PAH的程度。

脊椎動(dòng)物中3種鈉尿肽基因已被證實(shí)來(lái)自于CNP-3基因的復(fù)制[10]。哺乳動(dòng)物含有兩個(gè)這種基因，分別是Nppa和Nppb。在基因組中，它們各自相差幾Kbp的距離。BNP的上游基因存在大量的非編碼區(qū)。ANF和BNP的監(jiān)管序列在這些位點(diǎn)中隨處可見(jiàn)，相距幾個(gè)到成百上千的Kbp距離。此外，考慮到表達(dá)模式非常相似和ANF與BNP產(chǎn)生的過(guò)度肥厚反應(yīng)，這些基因可能共用同一個(gè)監(jiān)管序列。類(lèi)似的例子可以在諸如Irx基因和MHC基因的其他族群基因的表達(dá)監(jiān)管中發(fā)現(xiàn)。ANF/BNP基因族群的調(diào)控元件可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子和心臟組織特定組蛋白修飾共同的作用而被辨別[11-12]。

2016 年筆者團(tuán)隊(duì)研究顯示風(fēng)濕性心臟病患者BNP基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯高于對(duì)照組，并進(jìn)一步闡明了長(zhǎng)期服用華法林抗凝的瓣膜置換術(shù)后的患者BNP基因甲基化水平高于對(duì)照組，其他影響因素中，包括年齡，性別等均做了相應(yīng)對(duì)照分析[13]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)旨在研究風(fēng)濕性心臟病患者中PAH對(duì)BNP基因啟動(dòng)子甲基化水平的影響，結(jié)果表明PAH患者中BNP基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化率相對(duì)正常人顯著增多，表明BNP基因甲基化在PAH發(fā)病機(jī)制中起到一定作用。尤其在PAH越高的情況下，BNP基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化率較正常對(duì)照組差異越明顯，其在pos.4位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)中度PAH組和高度PAH組也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說(shuō)明PAH患者隨著疾病的進(jìn)展，BNP基因位點(diǎn)甲基化也逐步增多。在臨床上是否可以通過(guò)識(shí)別BNP基因甲基化位點(diǎn)，人工誘使其去甲基化是否對(duì)風(fēng)濕性心臟病繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓患者的疾病轉(zhuǎn)歸提供幫助，待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。