李文杰，羅遠(yuǎn)，劉婷，姚麒

帕金森?。≒D）主要病理改變?yōu)槎喟桶纺苌窠?jīng)元缺失，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，而PD患者最常見的非運(yùn)動癥狀就是認(rèn)知功能障礙（CI）[1]。黑果小檗是一種落葉灌木植物，資源豐富，具有強(qiáng)胃、生津止渴、清熱解毒的功效[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，黑果小檗果實(shí)中花色苷具有增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)，提高老齡動物的記憶力，調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)傳遞等治療神經(jīng)退行性疾病的作用[3]。Klotho是一種衰老抑制基因，Kl蛋白功能下降會導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量下降，抑制多巴胺的合成，PI3K-PKB磷酸化激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FoxO，進(jìn)而參與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、衰老及代謝[4]。本研究探究黑果小檗總花色苷（BHSTA）對帕金森大鼠的認(rèn)知行為能力、神經(jīng)保護(hù)及Klotho基因表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 80只SPF級雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g，8周齡，均置于溫度為22～25℃，濕度為40%～50%的動物房內(nèi)統(tǒng)一飼養(yǎng)。

1.2 藥材 黑果小檗源于烏魯木齊市南山山區(qū)，經(jīng)鑒定為小檗科小檗屬植物黑果小檗的果實(shí)，提純后得到BTA凍干粉末（含量為39%）。

1.3 試劑 鹽酸阿撲嗎啡，6-羥基多巴（6-OHDA），多聚甲醛，中性樹脂，Klotho抗體、Foxo3a及P-Foxo 3a抗體。

1.4 PD大鼠模型制備 80只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組15只，模型組65只，將65只大鼠參照文獻(xiàn)[5]中雙靶點(diǎn)注射法制備PD-CI大鼠模型。水合氯醛麻醉大鼠并固定，大鼠的頭部用腦立體定位儀固定，在黑質(zhì)致密部和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)，15 min內(nèi)用微量注射器注入4 g/l的6-OHDA。7 d后，大鼠均腹腔注射0.5mg/kg鹽酸阿撲嗎啡，誘導(dǎo)大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，并記錄注射后30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)：旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7次/min。在制成PD大鼠模型過程中有5只大鼠死亡，剩下60只大鼠均制備成功。假手術(shù)組大鼠注射等量含0.2 g/L抗壞血酸的0.9%氯化鈉注射液，手術(shù)方法同模型組。

1.5 大鼠分組及給藥 將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為模型組（予0.9%氯化鈉注射液灌胃）、低劑量組（予54.6mg/kg BHSTA灌胃）、中劑量組（予109.3 mg/kg BHSTA灌胃）和高劑量組（予218.6 mg/kg BHSTA灌胃），各15只。假手術(shù)組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃干預(yù)。1次/d，連續(xù)給藥28d。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)檢測 觀察大鼠行為改變，行旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，記錄30min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，并計(jì)算其平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

懸掛實(shí)驗(yàn)：將大鼠前肢懸掛于離地面30 cm高的金屬絲上，記錄從開始懸掛至落地時的時間并評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：持續(xù)0～5 s記為0分，6～10 s記為1分；11～15s記為2分，16～20s記為3分，21～25 s記為4分，26～30 s記為5分，超過30 s記為6分，實(shí)驗(yàn)3次，取平均值，每次實(shí)驗(yàn)時間間隔約2 min。

1.7 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 將水池分為大小相同的4個象限，于3象限內(nèi)的中間位置放置一個圓形的位于水面下2cm的黑色站臺，并在池壁內(nèi)側(cè)做好不同形狀的標(biāo)記。將攝像機(jī)置于迷宮的上方，記錄大鼠的運(yùn)動軌跡。計(jì)算大鼠在平臺所有象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）。

1.8 樣本采集 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠腦組織，分離獲得腦黑質(zhì)，一部分用多聚甲醛固定，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫涣硪徊糠謨龃嬗谝旱小?/p>

1.9 TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡 用多聚甲醛固定備用的腦黑質(zhì)，24 h后石蠟包埋，切片，置于冰箱備用。取出切片，洗滌后封閉1 h。加入一抗在4℃的環(huán)境中孵育過夜；再次洗滌后加入帶有熒光標(biāo)記的二抗，孵育1 h后洗滌，置于顯微鏡下觀察。

1.10 蛋白質(zhì)印跡測定腦黑質(zhì)中Klotho、Foxo3a、p-Foxo3a蛋白表達(dá) 取液氮凍存的腦黑質(zhì)，研磨裂解后取蛋白樣本。取30g蛋白樣本煮沸、電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)印，加入Klotho及p-Klotho一抗、Foxo3a及p-Foxo3a一抗、羊兔抗HRP標(biāo)記二抗，蛋白質(zhì)印跡法測定神經(jīng)元內(nèi)Klotho和p-Foxo3a蛋白表達(dá)，并測定蛋白的相對灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BHSTA對大鼠的神經(jīng)保護(hù)功能 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增多，懸掛實(shí)驗(yàn)評分降低（均P＜0.05）；低、中和高劑量組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)少于模型組，懸掛實(shí)驗(yàn)評分高于模型組（均P＜0.05）；高劑量組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)低于低劑量組，懸掛實(shí)驗(yàn)評分高于低劑量組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和懸掛實(shí)驗(yàn)評分比較

2.2 BHSTA對大鼠認(rèn)知功能影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠PT%、T%值降低（均P＜0.05）；低、中和高劑量組PT%、T%值均高于模型組（均P＜0.05）；高劑量組大鼠PT%、T%均高于低劑量組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠PT%、T%比較

2.3 BHSTA對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 相對于假手術(shù)組，模型組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多（均P＜0.05）；而與模型組相比，低、中和高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡均降低（均P＜0.05），且凋亡程度呈濃度遞減趨勢，高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況低于低劑量組（均P＜0.05），見封二彩圖1。

2.4 Klotho、Foxo3a、p-Foxo3a蛋白的表達(dá)情況 與假手術(shù)組相比，模型組Klotho和Foxo3a蛋白表達(dá)顯著降低，p-Foxo3a蛋白表達(dá)明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，低、中和高劑量組Klotho和Foxo3a蛋白表達(dá)均不同程度的增加，p-Foxo3a蛋白表達(dá)均顯著降低（均P＜0.05），且高劑量組蛋白變化與低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見封二彩圖2。

3 討論

PD是一種椎體外系變性疾病，臨床常用手術(shù)干預(yù)或藥物替代治療，但手術(shù)創(chuàng)傷和藥物依賴會加重認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)[6]。黑果小檗果實(shí)中的花色苷有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，常用于治療亨廷頓病、局部缺血性腦卒中等疾病[7]，但關(guān)于BHSTA應(yīng)用于PD的研究少有報(bào)道。本研究顯示模型組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增多，懸掛試驗(yàn)評分降低；BHSTA干預(yù)后的低、中、高劑量組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，懸掛實(shí)驗(yàn)評分升高。這提示BHSTA可改善PD大鼠的神經(jīng)功能。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BHSTA能增加PT%和T%值，增強(qiáng)PD大鼠的認(rèn)知記憶能力。既往研究也證實(shí)，BHSTA可有效改善AD大鼠的CI和腦組織損傷[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，PD患者臨床表現(xiàn)有腦萎縮，主要累及海馬、鉤回及后扣帶回等部位。PD-CI腦功能的退行性改變可能與海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體損傷、自由基調(diào)節(jié)失衡、能量代謝障礙或細(xì)胞衰老有關(guān)[9]。Klotho基因與衰老的調(diào)控關(guān)系密切，Klotho基因缺陷的大鼠通常會出現(xiàn)衰老等癥狀，通過增加Klotho基因表達(dá)，可抑制胰島素樣生長因子-1信號，進(jìn)而延長大鼠的壽命，Klotho高表達(dá)可以抑制其下游Akt激活底物中的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化[10]。即Klotho減少會激活A(yù)kt通路，導(dǎo)致Foxo3a轉(zhuǎn)錄因子磷酸化和細(xì)胞中SOD表達(dá)減少，積聚MDA，進(jìn)而對細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和DNA造成損傷，致細(xì)胞衰老。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠Klotho、Foxo3a表達(dá)顯著降低，p-Foxo3a表達(dá)升高。這說明PD大鼠神經(jīng)元Foxo3a表達(dá)降低，使進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的Foxo減少，引起細(xì)胞衰老；通過BHSTA干預(yù)使PD大鼠的Klotho、Foxo3a表達(dá)增加，減少PD大鼠的神經(jīng)細(xì)胞衰老。王思夷等[11]研究證實(shí)，鹽酸多奈哌齊可能通過上調(diào)海馬區(qū)的Klotho表達(dá)，抑制Akt和Foxo3a磷酸化，提高血清SOD含量，進(jìn)而提高PD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。有研究表明黑豆提取物花色苷可提高老年大鼠學(xué)習(xí)能力，調(diào)控膽堿能神經(jīng)傳遞及線粒體相關(guān)凋亡蛋白活性，從而降低神經(jīng)元凋亡，對大鼠神經(jīng)退行性病變、腦損傷等多種神經(jīng)疾病均有一定改善作用[12]。

綜上所述，BHSTA可改善PD大鼠認(rèn)知行為能力，保護(hù)大鼠的神經(jīng)功能，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控Klotho、Foxo3a信號通路實(shí)現(xiàn)。