謝晨，熊澤語，李慧，金素萊曼，陳百科，包海蓉,2*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

三文魚屬于冷水性的高度洄游魚類，主要分布在挪威、加拿大、美國(guó)等地區(qū)。三文魚肉呈橙紅色，肉質(zhì)細(xì)膩，口感鮮美，且富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等多種不飽和脂肪酸，深受中國(guó)消費(fèi)者青睞。中國(guó)市場(chǎng)上的三文魚以進(jìn)口三文魚為主，2012—2019年中國(guó)三文魚市場(chǎng)平均增速在19%左右，2019年的進(jìn)口量達(dá)9萬t。然而，由于三文魚具有較高的水分活性和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在宰殺后魚體極易發(fā)生腐敗。為了延長(zhǎng)三文魚保質(zhì)期，常常將屠宰后的三文魚進(jìn)行冷凍保藏。常用的凍藏溫度有-18 ℃和超低溫(-40 ℃及以下)。與-18 ℃凍藏相比，超低溫凍藏雖能更好地保持三文魚的品質(zhì)，但其對(duì)儀器設(shè)備的要求更高，投資成本更大，而且無法精確地控制凍藏溫度[1]。三文魚在-18 ℃時(shí)，凍結(jié)率已達(dá)到90%，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的凍藏，三文魚蛋白發(fā)生冷凍變性，脂肪逐步氧化，這些因素均會(huì)導(dǎo)致三文魚品質(zhì)劣變。目前添加抗凍劑是防止蛋白變性的主要方法，工業(yè)上常用的商業(yè)抗凍劑為4%蔗糖和4%山梨醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù))混合液。但由于傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑高甜高熱量的特點(diǎn)與如今消費(fèi)者追求健康低熱量的消費(fèi)趨勢(shì)不符，因此尋找天然、健康、高效的新型抗凍劑成了目前科研人員研究的熱點(diǎn)。

金針菇多糖(polysaccharide fromFlammulinavelutipes，F(xiàn)VP)是從金針菇中提取出的水溶性多糖，是金針菇的主要活性成分，早在1968年日本就有關(guān)于FVP的研究報(bào)導(dǎo)[2]。到如今，F(xiàn)VP雖然已經(jīng)引起了部分學(xué)者的關(guān)注，但目前關(guān)于FVP的國(guó)內(nèi)外研究均集中于抗氧化[3]，促進(jìn)腸道健康[4]，免疫調(diào)節(jié)[5]等方面，對(duì)于將多糖應(yīng)用于水產(chǎn)品抗凍劑的研究鮮有報(bào)導(dǎo)。

本文通過研究不同濃度FVP浸漬處理的三文魚片在-18 ℃凍藏4個(gè)月后的Ca2+-ATPase活性，巰基，硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substance，TBARS)，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以及冰晶大小變化，并與蒸餾水處理以及商業(yè)抗凍劑處理進(jìn)行對(duì)比，探討將FVP作為水產(chǎn)品抗凍劑使用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰鮮三文魚，購(gòu)于上海東方國(guó)際水產(chǎn)中心，在產(chǎn)地屠宰、去除內(nèi)臟后，冰藏，約2 d運(yùn)至上海。由商店專業(yè)人員進(jìn)行剔骨、去皮，只取中段背部肌肉，裝入保鮮袋，冰藏，2 h內(nèi)至實(shí)驗(yàn)室。

蔗糖、硫代巴比妥酸、山梨醇、氯化鉀、濃硫酸、二甲苯、5，5′-二硫代雙、三氯乙酸、蘇木精、伊紅、曲拉通(Tritonx-100)、鉬酸銨、硫酸亞鐵、無水乙醇、濃鹽酸、無水硫酸銅等，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FA2004 型電子天平，南京東邁科技儀器有限公司；ECLIPES 80i高級(jí)研究級(jí)顯微鏡，日本尼康株式會(huì)社；SG2 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；D-130電動(dòng)勻漿機(jī)，維根技術(shù)(北京)有限公司；LRH-100CL 低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GL-20B 高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理

金針菇洗凈、凍干、碾成粉末，用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))KOH溶液于100 ℃處理2.5 h，10 000 r/min離心15 min， 重復(fù)3次后蒸發(fā)濃縮上清液，在濃縮液中加乙酸中后加過量乙醇，使?jié)饪s液產(chǎn)生沉淀，將沉淀清洗、透析、過柱純化，得到FVP，分子質(zhì)量為106 kDa。

三文魚段運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，立即將其切成10 cm×5 cm×2 cm的魚片，然后將魚片隨機(jī)分成5組，分別在蒸餾水，0.09、0.12、0.15 mg/mL FVP以及4%蔗糖和4%山梨醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)混合液中浸漬10 min， 撈出后瀝干表面水分，裝入自封袋中。所有樣品先放到-60 ℃冰箱中快速降至中心溫度-18 ℃，然后再置于-18 ℃冰箱貯存，每隔15 d隨機(jī)取樣測(cè)定指標(biāo)，每組指標(biāo)做3個(gè)平行組。

1.2.2 肌原纖維蛋白提取

參照KATOH等[6]的方法進(jìn)行肌原纖維蛋白的提取，每個(gè)樣品取5 g剁碎的三文魚肉依次加入40 mL 不同蛋白提取液10 000 r/min均質(zhì)2 min，在4 ℃、 5 000 r/min離心15 min，除去離心上清液，取沉淀進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，蛋白提取液依次為:40 mmol/L Tris-Maleat，0.16 mol/L KCl，1% Triton，pH 7.5; 40 mmol/L Tris-Maleat，0.16 mol/L KCl，pH 7.5，提取過程全程冰浴，提取完后用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度，配制成2 mg/mL 進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測(cè)定，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 TBARS值

參考SALIH等[7]的方法測(cè)定TBARS值，略有改動(dòng)。取將三文魚肉剁碎，稱取5.00 g加入25 mL 20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸，均質(zhì)成勻漿，靜置2 h后10 000 r/min 離心15 min，然后將上清液用蒸餾水定容至50 mL，取5 mL混合液加入5 mL 0.02 mol/L 的硫代巴比妥酸溶液，沸水浴20 min。水浴后流水冷卻至澄清，在532 nm出測(cè)定吸光度。

1.2.4 總巰基含量

依據(jù) SIMPLICIO等[8]的方法測(cè)定總巰基含量，在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度。每毫升2 mg/mL的肌原纖維蛋白加入9 mL Tris-HCl緩沖液(8 mol/L尿素、10 mmol/L 二乙烯三胺、2%十二烷基硫酸鈉，pH 6.8)，然后根據(jù)5，5′-二硫代雙顯色結(jié)果計(jì)算巰基含量。

1.2.5 Ca2+-ATPase 活性

根據(jù) BENJAKUL等[9]的方法進(jìn)行測(cè)定三文魚Ca2+-ATPase 活性，結(jié)果以1 mg蛋白每分鐘生成無機(jī)磷量(μmol)來表示。

1.2.6 顯微鏡觀察

組織切片參考KAALE等[10]的方法，略作修改。將三文魚片切成4 cm×4 cm×3 mm小塊置于Carnoy試劑(乙醇與冰醋酸體積比3∶1)，-18 ℃固定24 h。依次使用70%、80%、90%、95%、100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫水1 h，然后使用二甲苯透明45 min，65 ℃浸蠟2 h，用石蠟包埋后切成8 μm薄片，37 ℃烘片4 h，然后進(jìn)行脫蠟，用伊紅和蘇木精染色，使用光學(xué)顯微鏡尼康ECLIPES 80i觀察。

1.2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)

參考劉芳芳等[11]的方法，將蛋白樣品凍干，將干粉與溴化鉀以質(zhì)量比1∶100的比例研磨壓片，用傅里葉紅外光譜在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Origin Pro 9.1進(jìn)行圖像繪制，SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體使用單因素ANOVA中的Duncan模型，P<0.05表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TBARS值

脂肪氧化會(huì)產(chǎn)生過氧化物，這些過氧化物隨后會(huì)降解成醛、酮等次級(jí)產(chǎn)物，這些化合物會(huì)加劇油脂的酸敗，并產(chǎn)生刺鼻的氣味[12]。硫代巴比妥酸法就是利用氧化終產(chǎn)物會(huì)與硫代巴比妥酸在高溫下生成紅色產(chǎn)物的原理測(cè)定脂肪氧化情況。魚類凍藏過程中同樣會(huì)發(fā)生脂肪氧化，凍藏中生成的冰晶會(huì)破壞細(xì)胞，使之釋放出促進(jìn)氧化的物質(zhì)[13]。對(duì)于多脂魚來說，脂肪氧化造成的品質(zhì)劣變比微生物的影響更大[14]。當(dāng)TBARS值>0.5 mg MDA/kg時(shí)，脂肪氧化產(chǎn)生的異味可被聞到[15]。如圖1所示，新鮮三文魚的TBARS值為(0.08±0.02) mg MDA/kg，凍藏過程中TBARS值不斷上升。其中，蒸餾水組TBARS值增加最快，在120 d達(dá)到0.585 mg MDA/kg，F(xiàn)VP組和商業(yè)抗凍劑均能有效抑制TBARS值的增長(zhǎng)(P<0.05)，0.15 mg/mL FVP抑制效果最好。FVP具有清除自由基的能力，即使多糖的添加量很少，也能達(dá)到抗氧化效果。凍藏過程中TBARS值的主要影響因素為氧氣，除了添加抗氧化劑外還可以選用氧氣阻隔性更好的包裝材料來抑制脂肪氧化。還有研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)凍融使細(xì)胞中的水分發(fā)生重結(jié)晶，產(chǎn)生大冰晶破壞細(xì)胞膜，從而加速肉類脂肪氧化[16]。因此，在凍藏過程中控制凍藏溫度穩(wěn)定也是保持肉類品質(zhì)的方法。

圖1 FVP對(duì)凍藏三文魚片TBARS值的影響

2.2 總巰基含量

總巰基包括活性巰基和隱藏巰基，是穩(wěn)定蛋白空間結(jié)構(gòu)，反映蛋白氧化程度的重要指標(biāo)。其中，活性巰基又可分為在肌球蛋白頭部的SH1、SH2和位于輕鏈酶解肌球蛋白中的SHa[17]。蛋白冷凍變性會(huì)造成蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隱藏巰基暴露，蛋白發(fā)生交聯(lián)產(chǎn)生二硫鍵[18]，從而使巰基含量進(jìn)一步下降，其中，活性巰基更容易被氧化成二硫鍵。此外，高溫貯藏也會(huì)使巰基含量下降[19]。各組三文魚總巰基含量的變化如圖2所示。在前30 d，巰基含量下降幅度較大，而后下降趨勢(shì)變緩，到貯存末期，蒸餾水、0.09、0.12、 0.15 mg/mL FVP，4%蔗糖+4%山梨醇處理組的總巰基含量分別為初始值的21.3%、27.4%、29.8%、34.7%、31.4%。三文魚蛋白在貯藏前期巰基下降最快可能是因?yàn)樵谇捌诩词沟鞍桌鋬鲎冃猿潭容^小，但暴露在蛋白分子外部的巰基已被氧化[20]。到貯藏后期，蛋白變性和脂肪氧化產(chǎn)生的自由基可能是巰基含量進(jìn)一步下降的主要原因。FVP和商業(yè)抗凍劑處理組的巰基含量始終高于蒸餾水組可能是因?yàn)镕VP雖然濃度較低，但是其抗氧化作用抑制了巰基的氧化，而商業(yè)抗凍劑中較高濃度的蔗糖和山梨醇在三文魚片表面形成了一層糖膜，有一定阻隔氧氣的作用。

圖2 FVP對(duì)凍藏三文魚片總巰基含量變化影響

2.3 Ca2+-ATPase 活性

Ca2+-ATPase 活性常用單位時(shí)間內(nèi)肌球蛋白中的ATP酶被Ca2+賦活后催化ATP水解產(chǎn)生的無機(jī)磷含量來判斷[μmol/(mg·min)]。Ca2+-ATPase活性來源于肌球蛋白頭部。因此，可根據(jù)Ca2+-ATPase活性的下降程度來大致判斷肌原纖維蛋白變性情況。關(guān)于凍藏過程中Ca2+-ATPase活性下降的原因可能是肌球蛋白中的活性巰基氧化成二硫鍵，使得蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，肌球蛋白頭部與ATP的接觸減少[21]。此外，Ca2+-ATPase 活性還與蛋白分子中的氫鍵、二硫鍵以及疏水相互作用相關(guān)[22]。由圖3可知，前15 d，凍藏三文魚Ca2+-ATPase活性下降最明顯，降幅依次為34.1%、31.1%、24.5%、23.9%、26.9%，后期下降速度放緩?？傮w而言，F(xiàn)VP和商業(yè)抗凍劑都達(dá)到了抑制Ca2+-ATPase活性下降的作用(P<0.05)，貯藏末期各組Ca2+-ATPase活性依次為0.091、0.118、0.135、 0.182、0.166 μmol/(mg·min)。Ca2+-ATPase活性的變化過程與總巰基的變化相似，此結(jié)果與曹淑敏等[23]的研究結(jié)果一致。巰基中的SH1和SH2和Ca2+-ATPase都位于肌球蛋白頭部，蛋白變性過程中，肌球蛋白頭部更容易受到影響[23]。關(guān)于FVP抑制Ca2+-ATPase活性下降的原因可能是多糖含有大量羥基，這些羥基可以和蛋白中的水分子以氫鍵的形式結(jié)合，抑制了凍藏過程中結(jié)合水向自由水轉(zhuǎn)化，減少蛋白因結(jié)合水流失而脫水聚集變性。

圖3 FVP對(duì)凍藏三文魚片Ca2+-ATPase 活性的影響

2.4 冰晶生長(zhǎng)情況

凍藏是目前水產(chǎn)品的主要保藏方式，但由于凍藏設(shè)備的限制，在長(zhǎng)時(shí)間的凍藏過程中難免會(huì)產(chǎn)生溫度波動(dòng)，促進(jìn)水產(chǎn)品中的冰發(fā)生重結(jié)晶而造成冰晶數(shù)量減少，體積增大，細(xì)胞內(nèi)溶液因細(xì)胞外溶液冷凍濃縮而發(fā)生遷移，而使肌纖維發(fā)生脫水，冰晶體有更大的成長(zhǎng)空間[24]。這不僅會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，還會(huì)在水產(chǎn)品解凍后增大汁液流失率，從而造成水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)流失，減少水產(chǎn)品保質(zhì)期。

由圖4可知未經(jīng)冷凍的新鮮三文魚組織呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排列緊密，組織結(jié)構(gòu)清晰。凍藏120 d后，組織形狀發(fā)生了變化，肌纖維均有不同程度的破裂。三文魚組織使用固定劑固定后，被蘇木精和伊紅試劑染色，未被染上顏色的部分為凍藏時(shí)在組織中的冰晶。圖4中可以看到蒸餾水組的組織凍藏120 d后生成的冰晶較大，冰晶形狀不規(guī)整，組織被分成較小的塊狀。其余凍藏120 d的實(shí)驗(yàn)組生成的冰晶較小，并且可明顯在圖中看到冰晶的形狀較規(guī)則、圓潤(rùn)，對(duì)組織的破壞也較小。其中0.15 mg/mL 的FVP處理組生成的冰晶最為細(xì)小、致密，抑制重結(jié)晶效果最好。糖類含有大量羥基，可將水分子束縛在蛋白表面，抑制冰晶生長(zhǎng)[25]。羥基數(shù)目越多，糖的抗凍效果越好。FVP作為大分子多糖還可能形成玻璃態(tài)體系，在玻璃態(tài)體系下，組織中的水達(dá)到最大凍結(jié)濃縮狀態(tài)，此時(shí)水分子的遷移速度大大降低，可以有效避免蛋白之間聚集變性[26]以及冰的重結(jié)晶。

圖4 FVP對(duì)凍藏三文魚片冰晶大小的影響

2.5 紅外光譜分析

紅外光譜圖中波數(shù)為1 600～1 700 cm-1(酰胺Ⅰ帶)的區(qū)間常用來分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化[27]，確定蛋白各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。一般來說，β-折疊在1 600～1 640 cm-1附近有較強(qiáng)的吸收峰，無規(guī)卷曲的吸收峰出現(xiàn)在1 640～1 650 cm-1附近，α-螺旋在1 650～1 660 cm-1附近有弱吸收峰，β-轉(zhuǎn)角在1 660～1 700 cm-1附近。α-螺旋和β-折疊是二級(jí)結(jié)構(gòu)主要組成部分，兩者分別依賴分子內(nèi)氫鍵和分子間氫鍵形成[28]。本實(shí)驗(yàn)中，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以光譜圖二次求導(dǎo)后的吸收峰面積變化來表示蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，占比為峰面積比。

由圖5可知，凍藏120 d后，與新鮮三文魚相比，β-折疊比例下降，其余含量均有所上升。FVP處理的3個(gè)組β-折疊含量升高，β-轉(zhuǎn)角含量降低，無規(guī)卷曲含量略有降低，α-螺旋含量升高較少。4%蔗糖和4%山梨醇處理組β-折疊含量降低，無規(guī)卷曲含量略降，β-轉(zhuǎn)角含量略升，α-螺旋含量增加比例小于蒸餾水組，大于FVP處理組。不同抗凍保護(hù)劑對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響各有不同。凍藏過程中，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量是波動(dòng)變化的，低溫有利于α-螺旋的含量增加，與大分子糖相比，小分子糖處理會(huì)促進(jìn)α-螺旋的形成[29]。不同抗凍保護(hù)劑對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響各有不同。與無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角相比，α-螺旋和β-折疊是相對(duì)比較穩(wěn)定、有序的結(jié)構(gòu)，新鮮三文魚α-螺旋和β-折疊的總占比為70%左右，凍藏后蒸餾水組降低到約55%，F(xiàn)VP處理的魚片α-螺旋和β-折疊總和均保持在77%以上，因此FVP可能會(huì)使蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸由無序向有序轉(zhuǎn)變。

圖5 FVP對(duì)凍藏三文魚片蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分布的影響

3 結(jié)論與討論

魚肉的含水量高達(dá)70%～80%。魚體水分含量高，水分活性強(qiáng)，這是魚肉在常溫貯藏下比禽畜肉更容易受到微生物污染而腐敗變質(zhì)的重要原因。而在凍藏中，這2個(gè)因素也會(huì)造成魚體內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶，造成組織機(jī)械損傷。評(píng)價(jià)凍藏魚品質(zhì)的指標(biāo)，如巰基、TBARS值、Ca2+ATPase活性、持水性、冰晶等，往往是相互聯(lián)系的，即一個(gè)指標(biāo)的變化可能會(huì)造成其他指標(biāo)變化。冰晶的重結(jié)晶是指小冰晶升華形成的蒸氣聚集到大冰晶周圍，凝聚成更大的冰晶，以及組織內(nèi)未凍結(jié)部分的水遷移到大冰晶周圍促進(jìn)其生長(zhǎng)。FVP可以清除自由基，抑制TBARS值的上升和巰基被氧化，阻斷脂肪氧化產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)蛋白的破壞。同時(shí)，F(xiàn)VP通過羥基結(jié)構(gòu)和形成玻璃態(tài)固定水分子抑制水分子遷移，減少蛋白質(zhì)脫水聚集變性。同時(shí)，水分子遷移被抑制還可以減緩冰重結(jié)晶，生成小冰晶可以減少細(xì)胞完整性被破壞，減少魚肉營(yíng)養(yǎng)成分流失。在本研究中，0.09、0.12、0.15 mg/mL 的FVP均對(duì)抑制蛋白冷凍變性和脂肪氧化等起到了較好的效果，在此濃度范圍內(nèi)，0.15 mg/mL的FVP效果最佳。