蘇媛，劉川，谷振宇,4，夏苗苗，鐘成，張大偉*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308) 3(天津科技大學(xué),食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津, 300457) 4(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌，443002)

核黃素又名維生素B2，與動(dòng)植物的生長(zhǎng)密切相關(guān)，在生物體內(nèi)常以黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)兩種形式存在，發(fā)揮輔酶的作用。核黃素常被用作飼料添加劑、營(yíng)養(yǎng)添加劑、輔助藥物等，廣泛應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域[1]。目前核黃素工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的主要方法為微生物發(fā)酵法，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、棉囊阿舒酵母(Assultagossypii)等都是工業(yè)上常用的核黃素生產(chǎn)菌株[2-3]。

在核黃素的合成途徑中，鳥(niǎo)苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)是重要前體之一。它既可以利用糖類及氨基酸為原料進(jìn)行頭合成，也可以利用嘌呤堿為前體進(jìn)行補(bǔ)救合成[4]。在工業(yè)生產(chǎn)中，培養(yǎng)基成分復(fù)雜，尤其是酵母粉或酵母抽提物中含有一些嘌呤類物質(zhì)，理論上既可提供GTP合成的原料，又會(huì)對(duì)從頭合成產(chǎn)生抑制作用[5]。但在以酵母提取物、玉米漿為氮源的工業(yè)培養(yǎng)基中，補(bǔ)救合成途徑并不是核黃素合成的主要途徑[6]。因此通過(guò)嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的敲除調(diào)節(jié)胞內(nèi)嘌呤類物質(zhì)的含量，進(jìn)而解除培養(yǎng)基中嘌呤類物質(zhì)對(duì)從頭合成的抑制是一種潛在的提高核黃素產(chǎn)量的手段?？莶菅挎邨U菌基因組中存在7個(gè)被注釋為嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因(pbuG、nupG、pbuE、ywdJ、nupNOPQ、pbuX、pbuO)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PbuE為次黃嘌呤和腺嘌呤的外排蛋白[7-8]，PbuG為鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤的內(nèi)運(yùn)蛋白[9]，PbuX為黃嘌呤的內(nèi)運(yùn)蛋白[10]，PbuO為鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤的內(nèi)運(yùn)蛋白[9]。然而7種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)全部4種嘌呤堿的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，以及敲除轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響還沒(méi)有被系統(tǒng)的研究過(guò)。

本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加一定濃度的嘌呤堿對(duì)核黃素的合成有抑制作用。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失后，這種抑制的程度會(huì)發(fā)生改變。根據(jù)抑制程度的改變和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失突變體生長(zhǎng)表型的變化鑒定了7種嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)4種嘌呤堿的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并且本文構(gòu)建了一系列轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失菌株并測(cè)定了這些菌株的核黃素產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)涉及的菌株如表1所示。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用菌株

1.1.2 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10。

SPI(g/L)：硫酸銨1.96，磷酸氫二鉀13.72，磷酸二氫鉀5.88，檸檬酸鈉0.98，七水硫酸鎂0.196，葡萄糖5，酸水解酪素0.2，酵母抽提物1。

SPⅡ(g/L)：硫酸銨1.92，磷酸氫二鉀13.45，磷酸二氫鉀5.76，檸檬酸鈉0.96，七水硫酸鎂0.192，葡萄糖4.9，酸水解酪素0.196，酵母抽提物0.98，氯化鈣0.006，氯化鎂0.238。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：白玉米漿干粉15，玉米漿干粉1.5，蔗糖40，硫酸鎂0.5，硫酸銨5，酵母抽提物5，磷酸氫二鉀3，磷酸二氫鉀1，滅菌前用飽和NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2，121 ℃，滅菌30 min后，根據(jù)需要添加不同濃度的嘌呤堿。

SP基本鹽培養(yǎng)基(g/L)：SPI(不添加酸水解酪素和酵母抽提物)，色氨酸0.05，根據(jù)需要添加不同濃度的嘌呤堿。

1.1.3 主要試劑

腺嘌呤堿、次黃嘌呤堿、黃嘌呤堿、鳥(niǎo)嘌呤堿，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

EDC-810基因擴(kuò)增儀，東勝國(guó)際貿(mào)易有限公司；水平電泳儀，北京市六一儀器廠；94-Z水平搖床，寧波新芝生物科技股份有限公司；V-1600可見(jiàn)分光光度儀，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失突變菌株構(gòu)建方法

本實(shí)驗(yàn)所涉及的基因序列均來(lái)自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用SnapGene設(shè)計(jì)所用引物，由擎科生物公司合成(表2)。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物

續(xù)表2

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行無(wú)痕敲除[11]，以B.subtilis168基因組為模板，分別擴(kuò)增基因的上游同源臂(UP)、下游同源臂(DN)部分，以帶有cat+araR(CR)的菌為模板擴(kuò)增含有篩選標(biāo)記CR以及與同向重復(fù)序列DR(direct repeats)的部分，進(jìn)行3片段融合PCR，將產(chǎn)物用SPI-II轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入R菌中[12]，利用DR在LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)進(jìn)行同源重組，將篩選標(biāo)記去除，得到敲除菌株。具體敲除過(guò)程如圖1所示。

圖1 同源重組敲除原理圖

1.2.2 嘌呤從頭合成缺陷菌株的構(gòu)建

通過(guò)同源重組將嘌呤合成途徑中關(guān)鍵酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶編碼基因purF使用氯霉素抗性基因cat替換，阻斷嘌呤的從頭合成，構(gòu)建嘌呤從頭合成缺陷菌株RF、RFP、RFG、RFE、RFY、RFN、RFX、RFO。

1.2.3 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失對(duì)生長(zhǎng)影響的測(cè)定

挑取新鮮的單菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃， 200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，取適量菌液至1.5 mL EP管中，離心棄上清液，用同體積的無(wú)菌水洗滌1次，再用同體積的無(wú)菌水重懸并微調(diào)至相同OD600值，取50 μL轉(zhuǎn)接至添加不同嘌呤堿的SP基本鹽培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)30～40 h，每隔10～12 h測(cè)定其OD600。

1.2.4 核黃素濃度的測(cè)定

采用分光光度法測(cè)定核黃素濃度，取適量體積的發(fā)酵液，稀釋合適倍數(shù)，溶于0.1 mol/L NaOH 避光放置20 min，12 000 r/min，離心1 min，取上清液測(cè)定其在444 nm處的吸光度，確定核黃素濃度[13]。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

從-80 ℃凍存管中取20 μL菌液，涂布于LB固體平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，刮取全部菌苔至1 mL無(wú)菌水中，混勻后取適量菌液，以初始OD600=0.1接至含80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL帶擋板的三角瓶中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)42 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失菌株的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以及在KEGG(https://www.kegg.jp/)及subtiwiki(http://subtiwiki.uni-goettingen.de/)上查找到7種嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因：pbuG、nupG、pbuE、ywdJ、nupNOPQ、pbuX、pbuO。以實(shí)驗(yàn)室保藏的1株有一定核黃素產(chǎn)量的枯草芽孢桿菌R為出發(fā)菌株，根據(jù)1.2.1中的方法分別敲除了以上7種嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，構(gòu)建了一系列嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的菌株。

以敲除pbuG基因?yàn)槔?，以B.subtilis168基因組為模板，用引物UPpbuG-F、UPpbuG-R(含DR)，和引物DNpbuG-F、DNpbuG-R分別擴(kuò)增pbuG基因上下游的UP和DN片段，以實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中帶有CR片段的基因組為模板，用引物CR-F、CRpbuG-R(含DR)擴(kuò)增出CR片段。將所擴(kuò)增出的UP、CR、DN進(jìn)行片段融合，將融合后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入菌株R中，通過(guò)氯霉素抗性(8 μg/mL)篩選到CR替換pbuG的陽(yáng)性克隆，用引物UPpbuG-F、DNpbuG-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，正確的條帶大小應(yīng)為5 248 bp。正確的克隆轉(zhuǎn)接至無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直接重復(fù)序列DR重組之后，彈出篩選標(biāo)記CR，涂布在含40 μg/mL新霉素的LB固體培養(yǎng)上，即可得到篩選到目的基因的敲除的陽(yáng)性克隆，用引物UPpbuG-F、DNpbuG-R對(duì)克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，大小為3 179 bp即為敲除成功，未敲除成功的條帶大小為5 248 bp。

2.2 不同嘌呤物質(zhì)添加濃度的確定及其對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腺苷一磷酸(adenosine monophosphate， AMP)、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)、鳥(niǎo)苷一磷酸(guanosine monophosphate，GMP)、鳥(niǎo)苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)、GTP等均會(huì)抑制嘌呤的從頭合成途徑[14-15]。本實(shí)驗(yàn)基于如下假設(shè)：一旦發(fā)酵培養(yǎng)基中嘌呤堿濃度超過(guò)閾值，雖然通過(guò)補(bǔ)救合成途徑可以生成少量嘌呤核苷酸，但這些嘌呤核苷酸會(huì)對(duì)從頭合成途徑產(chǎn)生抑制，并且補(bǔ)救合成的嘌呤核苷酸不能彌補(bǔ)這種抑制導(dǎo)致的從頭合成GTP的損失，最終導(dǎo)致核黃素產(chǎn)量的降低。為了證明我們的假設(shè)，首先嘗試在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的4種嘌呤堿并檢測(cè)出發(fā)菌株R的核黃素產(chǎn)量變化。

發(fā)酵培養(yǎng)基中的腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤設(shè)置7個(gè)終質(zhì)量濃度梯度，分別為0、1、20、50、100、500、1 000 mg/L，添加1 000 mg/L的腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及100 mg/L的鳥(niǎo)嘌呤時(shí)核黃素產(chǎn)量降低最明顯，分別為29.22%、10.15%、17%、10.27%(圖2)，說(shuō)明該濃度的嘌呤堿對(duì)菌株R的核黃素合成具有較強(qiáng)的抑制效果。因此確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，4種嘌呤堿的添加終質(zhì)量濃度分別為腺嘌呤1 000 mg/L、次黃嘌呤1 000 mg/L、黃嘌呤1 000 mg/L、鳥(niǎo)嘌呤100 mg/L。

圖2 添加不同濃度的嘌呤堿對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響

敲除嘌呤內(nèi)運(yùn)蛋白和外排蛋白，可以阻礙發(fā)酵培養(yǎng)基中的嘌呤堿進(jìn)入細(xì)胞，或細(xì)胞中嘌呤堿的排出，導(dǎo)致嘌呤從頭合成途徑抑制程度的改變，而影響核黃素的產(chǎn)量。敲除nupNOPQ、pbuX、pbuO后，腺嘌呤對(duì)菌株核黃素產(chǎn)量的抑制程度分別減弱了65.30%、75.80%、58.50%，敲除pbuG、pbuE、ywdJ后，腺嘌呤對(duì)菌株核黃素產(chǎn)量的抑制程度分別增強(qiáng)了10.15%、159.90%、106.53%(圖3-a)；敲除nupG、pbuE、ywdJ、nupNOPQ、pbuX后，次黃嘌呤對(duì)菌株核黃素產(chǎn)量的抑制程度分別增強(qiáng)66.10%、45.60%、448.60%、197.20%、 245.80%(圖3-b)；敲除pbuG、pbuE、ywdJ、nupNOPQ、pbuO后，黃嘌呤對(duì)菌株核黃素產(chǎn)量的抑制程度分別減弱了66.10%、55.50%、82.60%、44.70%、34.40%，敲除nupG后，黃嘌呤對(duì)菌株核黃素產(chǎn)量的抑制程度增強(qiáng)了61.30%(圖3-c)；敲除pbuG、pbuE、ywdJ、nupNOPQ、pbuX、pbuO后，鳥(niǎo)嘌呤對(duì)菌株核黃素產(chǎn)量的抑制程度分別減弱了66.80%、217.90%、 133.60%、66.50%、82.20%、179.20%(圖3-d)。 說(shuō)明嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的缺失確實(shí)影響了嘌呤堿對(duì)核黃素合成的抑制作用。

a-1 000 mg/L腺嘌呤；b-1 000 mg/L次黃嘌呤；c-1 000 mg/L黃嘌呤；d-100 mg/L鳥(niǎo)嘌呤

2.3 嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在阻斷嘌呤從頭合成途徑后，細(xì)胞只能利用胞外的嘌呤堿進(jìn)行補(bǔ)救合成以維持細(xì)胞生長(zhǎng)，嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的敲除會(huì)影響細(xì)胞利用胞外嘌呤堿的能力，從而使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度發(fā)生改變。首先利用同源重組將嘌呤操縱子中的purF用氯霉素抗性基因cat替換，構(gòu)建了嘌呤從頭合成缺陷菌株RF。在SP基本鹽培養(yǎng)基中，若不添加任何嘌呤堿，在培養(yǎng)47 h后通過(guò)吸光度法檢測(cè)不到菌株RF生長(zhǎng)，而出發(fā)菌株R的OD600可長(zhǎng)至0.7左右，因此確定其成功阻斷了嘌呤從頭合成途徑。經(jīng)過(guò)測(cè)定RF菌株在SP基本鹽培養(yǎng)基中分別添加終質(zhì)量濃度為10 mg/L腺嘌呤(圖4-a)，20 mg/L次黃嘌呤(圖4-b)，20 mg/L 黃嘌呤(圖4-c)，20 mg/L鳥(niǎo)嘌呤(圖4-d)后培養(yǎng)至47 h時(shí)可恢復(fù)到與出發(fā)菌株R生長(zhǎng)相近的水平。

a-10 mg/L腺嘌呤；b-20 mg/L次黃嘌呤；c-20 mg/L黃嘌呤；d-20 mg/L鳥(niǎo)嘌呤

由圖5可知，敲除nupG、pbuE、ywdJ后，菌株在添加腺嘌呤的SP基本鹽培養(yǎng)基中生物量分別提高了10.43%、57.55%、20.50%，敲除nupNOPQ、pbuX、pbuO后，菌株在添加腺嘌呤的培養(yǎng)基中生物量分別降低了6.83%、8.27%、6.65%；敲除nupG、pbuE、nupNOPQ、pbuX后，菌株在添加次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生物量分別提高了11.65%、9.61%、16.69%、24.57%；敲除nupG后菌株在添加黃嘌呤的培養(yǎng)基中生物量分別提高了36.38%，敲除pbuG、pbuE、ywdJ、pbuX、pbuO后，菌株在添加黃嘌呤的培養(yǎng)基中生物量分別降低了5.87%、31.65%、19.25%、18.92%、29.04%；敲除nupG、pbuE、ywdJ后，菌株在添加鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基中生物量分別提高了8.12%、50.84%、30.63%，敲除pbuG、pbuX、pbuO后，菌株在添加鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基中生物量分別降低了38.44%、8.12%、15.47%。

圖5 嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失對(duì)生物量的影響

2.4 嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能分析

在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失對(duì)嘌呤堿對(duì)核黃素合成的抑制及缺失菌株在添加嘌呤堿的基本培養(yǎng)基中細(xì)胞生物量的變化兩方面實(shí)驗(yàn)判斷了7種嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)4種嘌呤堿的轉(zhuǎn)運(yùn)功能(表3)。一方面，我們通過(guò)核黃素產(chǎn)量的變化初步判斷PbuG可以外排腺嘌呤，內(nèi)運(yùn)黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤；NupG可外排次黃嘌呤和黃嘌呤；PbuE、YwdJ可能是主要的腺嘌呤外排蛋白，同時(shí)可以外排次黃嘌呤，內(nèi)運(yùn)黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤；NupNOPQ、PbuX、PbuO可內(nèi)運(yùn)腺嘌呤及鳥(niǎo)嘌呤，NupNOPQ、PbuX可以外排次黃嘌呤， NupNOPQ、PbuO還可內(nèi)運(yùn)黃嘌呤。另一方面，通過(guò)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)可以初步判定PbuG可以內(nèi)運(yùn)黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤；NupG可以外排4種嘌呤堿；PbuE可以外排腺嘌呤、次黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，內(nèi)運(yùn)黃嘌呤；YwdJ可外排腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤；NupNOPQ可外排次黃嘌呤，內(nèi)運(yùn)腺嘌呤和黃嘌呤；PbuX可外排次黃嘌呤，內(nèi)運(yùn)腺嘌呤、黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤；PbuO可內(nèi)運(yùn)腺嘌呤、黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤。

表3 由產(chǎn)量和生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的推測(cè)結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道的嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能結(jié)果

綜合上述兩方面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)只有其中1個(gè)實(shí)驗(yàn)證明的結(jié)果有7個(gè)，2個(gè)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生相反的結(jié)果有2個(gè)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的一致結(jié)果有17個(gè)。其中一致的結(jié)果如下：PbuG可以內(nèi)運(yùn)黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤；NupG可外排次黃嘌呤和黃嘌呤；PbuE可以外排腺嘌呤和次黃嘌呤，內(nèi)運(yùn)黃嘌呤；YwdJ可外排腺嘌呤；NupNOPQ可外排次黃嘌呤，內(nèi)運(yùn)腺嘌呤和黃嘌呤；PbuX可外排次黃嘌呤，內(nèi)運(yùn)腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤；PbuO可內(nèi)運(yùn)腺嘌呤、黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤。

通過(guò)比較文獻(xiàn)中利用其他實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證的嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)其與本文中的結(jié)果具有一定的一致性(表3)。

2.5 通過(guò)改造嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高核黃素的產(chǎn)量

通過(guò)搖瓶發(fā)酵測(cè)定了嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失菌株的核黃素產(chǎn)量。如圖6所示，發(fā)現(xiàn)不同嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失對(duì)核黃素的合成有一定的促進(jìn)或抑制作用。pbuG、nupNOPQ、pbuX的缺失菌株與出發(fā)菌株R相比，核黃素產(chǎn)量分別提高了7.53%、10.74%、5.84%；而pbuE、ywdJ的缺失菌株與出發(fā)菌株R相比，核黃素產(chǎn)量分別降低了7.72%、6.48%。

在測(cè)定添加不同濃度的嘌呤堿對(duì)核黃素產(chǎn)量影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加較低濃度的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤就會(huì)對(duì)核黃素產(chǎn)量產(chǎn)生抑制作用。因此推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的轉(zhuǎn)運(yùn)能力是對(duì)核黃素產(chǎn)量的關(guān)鍵影響因素。而單獨(dú)敲除腺嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤內(nèi)運(yùn)蛋白基因(除pbuO)和腺嘌呤外排蛋白基因分別提高和降低了核黃素產(chǎn)量。因此對(duì)本文中確定的3個(gè)編碼腺嘌呤內(nèi)運(yùn)蛋白基因nupNOPQ、pbuX、pbuO進(jìn)行了敲除構(gòu)建了菌株RNXO，同時(shí)構(gòu)建了敲除nupNOPQ、pbuX的菌株RNX，經(jīng)搖瓶驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)RNXO和RNX相較于出發(fā)菌株R的核黃素產(chǎn)量分別提高了11.39%、12.17%。在RNXO和RNX基礎(chǔ)上又分別敲除了鳥(niǎo)嘌呤內(nèi)運(yùn)蛋白基因pbuG，得到了RNXOP和RNXP，二者的核黃素產(chǎn)量較出發(fā)菌株R分別提高了17.81%、19.14% (圖6)。

圖6 嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失菌株的核黃素產(chǎn)量

3 結(jié)論與討論

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)鑒定PbuE、YwdJ具有外排腺嘌呤的功能，NupNOPQ、PbuX、PbuO具有內(nèi)運(yùn)腺嘌呤的功能；NupG、PbuE、NupNOPQ、PbuX具有外排次黃嘌呤的功能；NupG具有外排黃嘌呤的功能；PbuG、PbuE、NupNOPQ、PbuO具有內(nèi)運(yùn)黃嘌呤的功能；PbuG、PbuX、PbuO具有內(nèi)運(yùn)鳥(niǎo)嘌呤的功能?；谄滢D(zhuǎn)運(yùn)功能，在實(shí)驗(yàn)室已有菌株R基礎(chǔ)上對(duì)腺嘌呤及鳥(niǎo)嘌呤的內(nèi)運(yùn)蛋白基因nupNOPQ、pbuX、pbuG進(jìn)行了敲除，將核黃素產(chǎn)量提高了19.14%。

文獻(xiàn)報(bào)道，嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的敲除會(huì)影響嘌呤核苷的產(chǎn)量，嘌呤核苷的生產(chǎn)菌株中也會(huì)存在一些嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變[16-17]。這些敲除和突變可能影響了菌株嘌呤核苷酸的從頭合成能力。本文中鑒定的一些腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與核黃素產(chǎn)量有一定的關(guān)系。除pbuO以外，敲除其他腺嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤的內(nèi)運(yùn)蛋白基因后核黃素產(chǎn)量均有所提高，而敲除外排蛋白的菌株核黃素產(chǎn)量均降低。文獻(xiàn)報(bào)道PbuO的鳥(niǎo)嘌呤的轉(zhuǎn)運(yùn)能力在大于100 μmol/L時(shí)才能體現(xiàn)[8]，因此在我們的培養(yǎng)基中鳥(niǎo)嘌呤的含量沒(méi)有達(dá)到該濃度，而當(dāng)培養(yǎng)基中額外添加100 mg/L 的鳥(niǎo)嘌呤后，敲除pbuO提高了核黃素的產(chǎn)量(圖3)。因此由于發(fā)酵培養(yǎng)基成分的差異，對(duì)嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲除的效果也會(huì)出現(xiàn)差異。本文對(duì)嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的敲除結(jié)果對(duì)核黃素生產(chǎn)菌株的改造具有一定的參考意義。

前人對(duì)于枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的方法已經(jīng)有了詳細(xì)的研究，在最新的綜述中，這些研究方法已經(jīng)被歸納匯總[3,18]。WANG等[19]通過(guò)整合基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解析了1株高產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的高產(chǎn)機(jī)制，并通過(guò)逆向代謝工程從頭構(gòu)建了核黃素生產(chǎn)菌株，其搖瓶產(chǎn)量達(dá)到4.2 g/L。BOUMEZBEUR等[20]通過(guò)點(diǎn)突變核糖開(kāi)關(guān)，在保持細(xì)胞正常生長(zhǎng)的前提下解除了嘌呤操縱子和核黃素操縱子的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，提高了核黃素的產(chǎn)量。而本文首次報(bào)道了通過(guò)改造嘌呤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高核黃素產(chǎn)量的方法，為核黃素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供了新的思路。