林大河，吳錦程*，林順權(quán)，3*

(1.莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100；2.莆田學(xué)院 枇杷種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642)

0 引言

現(xiàn)代顯微技術(shù)的進(jìn)步不斷推動(dòng)著生物學(xué)從宏觀向微觀世界拓展，促進(jìn)了動(dòng)、植物組織解剖學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及分子生物學(xué)的長(zhǎng)足進(jìn)步。即使像枇杷(Eriobotrya japonicaLindl.)這樣的中小宗果樹(shù)也不例外。

枇杷是起源于中國(guó)南方的特色水果，在中國(guó)有2000多年的種植記載，但宋朝才傳到日本，18世紀(jì)才傳到歐洲和北美洲[1-2]。中國(guó)雖然很早種植枇杷，但組織解剖學(xué)等現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展滯后；日本自20世紀(jì)初開(kāi)始，在育種尤其是雜交育種方面發(fā)展迅速并較長(zhǎng)時(shí)間占據(jù)世界先進(jìn)位置，但是在枇杷顯微解剖學(xué)方面和中國(guó)類似，也幾乎沒(méi)有涉及。

真正開(kāi)始較多應(yīng)用顯微切片技術(shù)于枇杷科研的，是我國(guó)浙江大學(xué)(當(dāng)時(shí)的浙江農(nóng)學(xué)院)的李乃燕等在枇杷花芽分化方面的研究[3-4]，隨后我國(guó)有多家單位廣泛開(kāi)展針對(duì)枇杷的種質(zhì)資源、果實(shí)發(fā)育及采后貯藏等的研究。見(jiàn)微而知著，顯微技術(shù)為深入了解枇杷微觀結(jié)構(gòu)提供支持，再結(jié)合一些現(xiàn)代生物學(xué)研究手段，必將為枇杷產(chǎn)業(yè)的快速健康發(fā)展提供強(qiáng)大的助力。

本文綜述目前常用于枇杷的4種顯微切片技術(shù)(徒手切片、石蠟切片、超薄切片和冰凍切片)所取得的科研進(jìn)展。其他的顯微技術(shù)如壓片觀察染色體、掃描電鏡觀察花粉粒，以及一些枇杷組織化學(xué)的研究均不在本文的討論范圍。

1 徒手切片(freehand slice)

徒手切片通常是指操作者持鋒利刀片將固定過(guò)的或新鮮的實(shí)驗(yàn)材料切成薄片的技術(shù)[5]，常用于研究動(dòng)、植物的解剖結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)成分和植物資源鑒定等。徒手切片的操作步驟相對(duì)石蠟切片和冰凍切片更簡(jiǎn)單，避免了石蠟切片繁瑣的脫水包埋過(guò)程，不用接觸二甲苯等有害有機(jī)物，而且所需工具價(jià)格低廉、簡(jiǎn)單易得，因此在快速植物組織觀察中仍具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于植物樣品，徒手切片可通過(guò)手持或工具輔助固定材料，另一手持單刀片進(jìn)行切片，也可以通過(guò)并列雙刀片或三刀片來(lái)獲得較薄的組織樣品。

由于成熟枇杷果肉較軟，較薄的切片容易導(dǎo)致鏡檢時(shí)樣品變形，薄壁細(xì)胞破裂，而較厚的切片透光差，在放大倍數(shù)較大時(shí)疊影嚴(yán)重，影響觀察。因此，徒手切片適用于結(jié)合體式顯微鏡來(lái)觀察枇杷嫩莖、葉片及果肉組織自然狀態(tài)下的粗略構(gòu)造，比如徒手切片可以應(yīng)用于查明枇杷花柱與心室在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的關(guān)系。嚴(yán)娟對(duì)‘大五星’枇杷盛花期的雌蕊進(jìn)行徒手切片(橫切和縱切)，并利用體式顯微鏡進(jìn)行鏡檢，為研究枇杷種子的退化機(jī)理提供了組織學(xué)依據(jù)[6]。在針對(duì)枇杷成熟期種子形態(tài)及不同時(shí)期果肉木質(zhì)化細(xì)胞分布的研究中，也經(jīng)常使用徒手切片沿枇杷果中央赤道面進(jìn)行橫剖，方便觀察及染色[6-8]。

該方法制得的切片還可用于掃描電鏡檢測(cè)及植物轉(zhuǎn)基因操作之后的初步觀察判斷。然而由于該法得到的切片厚度通常在毫米級(jí)，且很難控制均一的切片厚度，假如后續(xù)將進(jìn)行免疫組化、免疫熒光等檢測(cè)某組分在組織間的分布，則該方法分辨率較低，并不適用。

2 石蠟切片(paraffin sectioning)

石蠟切片技術(shù)出現(xiàn)可以追溯到1891年[9]，為組織學(xué)最經(jīng)典的技術(shù)之一，該技術(shù)經(jīng)不斷改進(jìn)，目前已經(jīng)十分成熟，切片的厚度通常在1～100μm。石蠟切片制作大概過(guò)程是:將樣品脫水，包埋于石蠟之中，而后利用切片機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行切片。該技術(shù)適用于幾乎所有的動(dòng)、植物樣品，能夠獲得均勻厚度的連續(xù)切片，搭配不同的顯微鏡可對(duì)組織進(jìn)行高倍放大觀察(可高達(dá)1600倍)。石蠟切片的最突出優(yōu)點(diǎn)在于可獲得連續(xù)切片，且切片的保存期很長(zhǎng)(-20℃可保存數(shù)年)。但石蠟切片技術(shù)對(duì)樣品處理過(guò)程繁瑣，處理堅(jiān)硬的材料時(shí)往往還需要利用乙二胺四乙酸(EDTA)進(jìn)行脫鈣等軟化處理，步驟繁復(fù)。

石蠟切片技術(shù)是應(yīng)用于枇杷上較早也較規(guī)范的一種顯微切片技術(shù)，為人們打開(kāi)了了解枇杷顯微結(jié)構(gòu)的窗口。隨著中國(guó)恢復(fù)成為世界最大枇杷生產(chǎn)國(guó)，石蠟切片為中國(guó)學(xué)者所廣泛重視[10]。該技術(shù)在枇杷組織解剖學(xué)中的應(yīng)用曾長(zhǎng)期集中在研究枇杷生殖過(guò)程尤其是胚胎發(fā)育上。

李乃燕等早在1982年應(yīng)用石蠟切片技術(shù)對(duì)‘單邊種’和‘洛陽(yáng)青’枇杷的花芽分化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)枇杷的花芽分化始于每年的8月，夏梢花芽發(fā)育所需時(shí)間短于春梢，春梢和夏梢的花芽同時(shí)于10月底成熟[3]。隨之，該課題組又進(jìn)一步以‘大紅袍’枇杷為材料，發(fā)現(xiàn)頂梢花序總軸原基分化始于8月中旬，支軸分化始于8月中旬末，花萼分化始于9月上旬末，9月中旬開(kāi)始出現(xiàn)花瓣原基，雌雄蕊原基分化始于9月下旬末[4]。2007年劉宗莉等以‘單邊種’ ‘洛陽(yáng)青’和‘早鐘六號(hào)’枇杷為材料對(duì)枇杷花芽的分化進(jìn)行系統(tǒng)研究，將枇杷花芽分化分為未分化期、誘導(dǎo)期、發(fā)端期、花序原基分化期和花器官分化期，并總結(jié)了誘導(dǎo)期水分脅迫、可溶性蛋白質(zhì)及內(nèi)源性激素對(duì)成花的影響[11]。2009年，林建城等利用石蠟切片技術(shù)比較了‘解放鐘’ ‘白梨’‘烏躬白’‘長(zhǎng)紅3號(hào)’和‘早鐘6號(hào)’枇杷果實(shí)形態(tài)結(jié)構(gòu)，并由此推測(cè)果實(shí)中石細(xì)胞(木質(zhì)化細(xì)胞)所處位置與果實(shí)耐貯性之間的關(guān)系[12]。

在枇杷胚胎學(xué)方面，福建農(nóng)林大學(xué)的相關(guān)團(tuán)隊(duì)做了較多的工作。鄭伸坤等利用番紅、蘇木精對(duì)‘和車本’和‘梅花霞’枇杷果實(shí)的石蠟切片進(jìn)行染色，研究胚和胚乳的發(fā)育，明確了枇杷胚胎發(fā)育的方式屬于十字花型，但與典型的十字花型胚胎發(fā)育又有不同之處，比如其胚柄由4～8列細(xì)胞組成，而典型十字花型原胚的基細(xì)胞僅形成一列細(xì)胞的胚柄；同時(shí)還明確了枇杷胚乳發(fā)育的方式屬核型胚乳，于授粉后50 d左右形成雙子葉典型幼胚[13]。陳振光、林順權(quán)等結(jié)合胚乳培養(yǎng)對(duì)枇杷胚胎發(fā)育進(jìn)行了較系統(tǒng)的觀察，發(fā)現(xiàn)根據(jù)授粉后天數(shù)來(lái)判斷胚胎發(fā)育進(jìn)程的不準(zhǔn)確性，總結(jié)了幼果外觀變化與胚胎相應(yīng)時(shí)期的對(duì)應(yīng)規(guī)律；正式提出不應(yīng)通過(guò)授粉天數(shù)，而應(yīng)利用幼果外觀來(lái)判斷枇杷胚胎發(fā)育情況的觀點(diǎn)[14-16]。

石蠟切片技術(shù)也可應(yīng)用于枇杷營(yíng)養(yǎng)組織的研究。2001年，鄭國(guó)華利用該技術(shù)觀察并探討了感染枇杷炭疽病的葉片與健康葉的差別，分析了枇杷炭疽病對(duì)葉片生理功能的影響，發(fā)現(xiàn)感染炭疽病葉片明顯皺卷為勺匙狀，表皮角質(zhì)化程度低，表皮絨毛萎卷，葉肉細(xì)胞分化低，柵欄組織和氣室均不明顯，葉綠體發(fā)育不正常[17]。2010年，張海嵐等將石蠟切片與掃描電鏡聯(lián)合應(yīng)用于野生枇杷作為栽培砧木的研究，在對(duì)19對(duì)砧穗組合的研究中發(fā)現(xiàn)野生種中的香花枇杷(Eriobotrya fragransChamp)、怒江枇杷(Eriobotrya salwinensisHand-Mazz)和櫟葉枇杷(Eriobotrya prinoidesRehd.&Wils.)作為砧木嫁接我國(guó)主要栽培枇杷品種‘早鐘6號(hào)’效果較佳，這些砧穗組合的嫁接口顯微切片顯示愈合程度好，雙方的愈傷組織細(xì)胞接合密切，未出現(xiàn)不親和組合那樣的斷裂面[18]。

石蠟切片技術(shù)應(yīng)用在枇杷組織學(xué)方面的研究由來(lái)已久，該技術(shù)能夠形成連續(xù)片帶，結(jié)合顯微鏡，能夠很方便地找到靶組織或器官，但是由于必須經(jīng)過(guò)脫水透蠟等繁復(fù)的步驟，導(dǎo)致綿軟的成熟枇杷果肉細(xì)胞失水變形，即使經(jīng)過(guò)復(fù)水，也難以恢復(fù)原大小，故石蠟切片觀察到的果肉組織各組分的尺寸可能與自然狀態(tài)下存在差異。利用石蠟切片技術(shù)獲得的切片還可用于RNA原位雜交、免疫組化、免疫熒光、掃描電鏡等的檢測(cè)。

3 超薄切片(ultrathin section)

超薄切片通常與透射電鏡聯(lián)合應(yīng)用于枇杷的組織學(xué)研究，一般利用戊二醛固定組織，經(jīng)乙醇梯度脫水，丙酮過(guò)渡之后包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中。環(huán)氧樹(shù)脂塊的硬度高于石蠟塊，因此能夠切出1μm以下厚度的超薄切片(通常切片厚度為50 nm)。通過(guò)與透射電鏡的結(jié)合，超薄切片能夠明顯提高鏡檢時(shí)的分辨率，能更清楚看清細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而方便探討細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的機(jī)理。超薄切片與電鏡聯(lián)合最早應(yīng)用于枇杷胚乳培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。陳振光等在胚乳培養(yǎng)時(shí)，對(duì)愈傷組織進(jìn)行超薄切片，觀察到胚性細(xì)胞，這些細(xì)胞壁厚、質(zhì)濃、液泡小，明顯區(qū)別于其周圍的一般愈傷組織細(xì)胞，正是這種胚性細(xì)胞可以分裂并分化成胚狀體[14]。1992年，林順權(quán)采用石蠟切片法、超薄切片法和胚囊酶法分離技術(shù)，觀察了‘梅花霞’等枇杷品種的胚胎發(fā)生，發(fā)現(xiàn):枇杷柱頭的中央有傳遞細(xì)胞；胚珠的外珠被細(xì)胞和內(nèi)珠被細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯不同，胚囊屬蓼型胚囊，胚囊內(nèi)有典型的卵器[16]。受精卵發(fā)育為原胚，經(jīng)歷球形、心形、魚(yú)雷形期后，成為成熟胚；核型胚乳于心形胚時(shí)形成細(xì)胞壁；文中還就一些胚胎學(xué)問(wèn)題作了簡(jiǎn)要的討論[16]。隨后何可鏳等比較了石蠟切片、半薄切片和超薄切片3種切片技術(shù)在進(jìn)行枇杷胚胎學(xué)觀察時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)了枇杷胚胎早期發(fā)生過(guò)程中“傳遞細(xì)胞”的分布，并討論了傳遞細(xì)胞對(duì)枇杷胚胎早期發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)作用[19-20]。因此，石蠟切片和超薄切片始終相輔相成地在對(duì)枇杷胚胎發(fā)育的組織學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持[19-20]。

超薄切片也被應(yīng)用于枇杷營(yíng)養(yǎng)器官的研究。2008年，廖汝玉等利用電鏡觀察到低或高鈣離子濃度均會(huì)損傷枇杷幼苗葉片細(xì)胞的線粒體和葉綠體等器官[21]。2009年，鄭國(guó)華等也利用超薄切片技術(shù)探討了低溫脅迫下枇杷葉片細(xì)胞線粒體和葉綠體膜結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度降到-2℃以下，枇杷的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)會(huì)受到嚴(yán)重的影響[22]。杜麗君等隨后研究了低溫對(duì)枇杷根尖細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)根尖細(xì)胞相對(duì)于葉片細(xì)胞對(duì)低溫脅迫更為敏感[23]。2015年，鄭婷婷等以不同顏色枇杷品種‘黃金塊’(橙紅)、‘解放鐘’(黃色)、‘白玉’(白色)在不同發(fā)育階段的果肉為試材，應(yīng)用光學(xué)和電子顯微鏡觀察果肉細(xì)胞質(zhì)體的大小、顏色和超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明:通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在果實(shí)成熟過(guò)程中‘黃金塊’‘解放鐘’枇杷果肉細(xì)胞中的質(zhì)體由葉綠體轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩w，而‘白玉’的果肉中沒(méi)有形成相應(yīng)的有色體；在對(duì)質(zhì)體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)在果實(shí)成熟過(guò)程中‘黃金塊’‘解放鐘’枇杷果肉細(xì)胞質(zhì)體中的質(zhì)體小球逐漸發(fā)育，到成熟期有大量的質(zhì)體小球出現(xiàn)，而‘白玉’枇杷果肉細(xì)胞質(zhì)體在成熟過(guò)程中沒(méi)有大量的質(zhì)體小球出現(xiàn)。由此明確了‘黃金塊’ ‘解放鐘’ ‘白玉’枇杷果肉的不同顏色可能與有色體的形成有關(guān)，而質(zhì)體小球的發(fā)育影響有色體的形成，最終表現(xiàn)為果肉顏色上的差異[24]。

利用超薄切片技術(shù)研究枇杷胚胎發(fā)育的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)細(xì)胞內(nèi)亞顯微結(jié)構(gòu)超高分辨率的解析，但其缺點(diǎn)也比較明顯，如目的結(jié)構(gòu)的定位和連續(xù)切片成帶均相對(duì)較難。超薄切片技術(shù)得到的切片通常應(yīng)用于透射電鏡的觀察。

4 冰凍切片(frozen section)

冰凍切片是利用低溫(-20～-40℃)將待切組織迅速凍結(jié)，達(dá)到一定的硬度以進(jìn)行切片，切片的厚度與石蠟切片近似，通常在5～100μm，應(yīng)用于枇杷的組織學(xué)研究中，較常用的厚度為30～40μm。但其與石蠟切片相比，無(wú)需脫水、透蠟、透明，簡(jiǎn)化了切片前的處理步驟，避免了樣品因脫水導(dǎo)致體積上發(fā)生的變化，同時(shí)也避免了因溫度變化導(dǎo)致的樣品內(nèi)蛋白構(gòu)象的嚴(yán)重改變，減少了與自然狀態(tài)下的差異。冰凍切片廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織樣品，能夠獲得均勻厚度的切片，在理想狀態(tài)下能夠獲得連續(xù)切片，所獲切片需置于低溫下方可長(zhǎng)期保存(如-80℃可保存一年，-20℃可保存半年)，對(duì)設(shè)備的要求較高(如需配置價(jià)格高昂的冰凍切片機(jī)和超低溫冰箱)。冰凍切片技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物組織的時(shí)間較早，應(yīng)用于植物組織的時(shí)間較晚。1968年，F(xiàn)isher將冰凍切片技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)植物內(nèi)源性RNA酶的定位[25]。1971年，Gahan等較系統(tǒng)地總結(jié)了將冰凍切片技術(shù)應(yīng)用于電鏡檢測(cè)的方法[26]。朱楠等結(jié)合冰凍切片技術(shù)和共聚焦顯微拉曼成像系統(tǒng)對(duì)‘白沙’枇杷果肉細(xì)胞壁組分空間分布的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素主要分布于木質(zhì)化細(xì)胞外圍邊緣，果膠主要分布于木質(zhì)化細(xì)胞與薄壁細(xì)胞之間的角隅，而薄壁細(xì)胞胞間層和角隅沉積的木質(zhì)素相比木質(zhì)化細(xì)胞含有更高比例的醛基結(jié)構(gòu)，揭示了枇杷果肉細(xì)胞壁多糖與木質(zhì)素空間分布的異質(zhì)性[7，27]。本課題組近期利用冰凍切片技術(shù)和間苯三酚染色對(duì)比了‘解放鐘’枇杷、臺(tái)灣枇杷(E.deflexaNakai)及種間雜種后代株系‘JT8’枇杷(‘解放鐘’枇杷為母本，臺(tái)灣枇杷為父本)三者的果肉石細(xì)胞的形態(tài)大小、數(shù)量、發(fā)育特性、分布動(dòng)態(tài)及其隨果實(shí)發(fā)育的消長(zhǎng)，結(jié)果清楚地顯示石細(xì)胞性狀可以在種間雜交的枇杷親子代間傳遞。這表明在枇杷的比較解剖學(xué)研究方面，冰凍切片與合適的染色方法的組合可以有很高的研究效率，比如在上述情景下，效率是石蠟切片的數(shù)倍。

經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，目前通過(guò)冰凍切片技術(shù)所獲得的切片可用于植物組織的免疫組化、免疫熒光及掃描電鏡等后續(xù)檢測(cè)。目前，將冰凍切片技術(shù)應(yīng)用于枇杷的組織學(xué)研究依然較少，但是由于該技術(shù)的便捷性和較廣泛的應(yīng)用范圍，在未來(lái)很可能在枇杷的組織學(xué)研究中發(fā)揮更大的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

綜觀上述4種顯微切片技術(shù)在枇杷研究上的進(jìn)展，可以看到它們均可為枇杷的內(nèi)構(gòu)觀察研究提供幫助，但各有短長(zhǎng):1)徒手切片法步驟簡(jiǎn)單、操作容易，能夠直接觀察果肉剖面，進(jìn)行宏觀和一定程度微觀的鏡檢，尤其是針對(duì)剖面整體鏡檢細(xì)微結(jié)構(gòu)(如維管束、石細(xì)胞團(tuán)等)時(shí)，能夠大大減少統(tǒng)計(jì)的工作量，是其他3種方法很難達(dá)成的；但其缺點(diǎn)也十分明顯，即分辨率低，由于厚度大導(dǎo)致容易重影。2)石蠟切片應(yīng)用于枇杷組織學(xué)研究源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，能制備連續(xù)切片，方便尋找目的結(jié)構(gòu)，是用于研究枇杷組織連續(xù)發(fā)育的最佳方法；但其缺點(diǎn)在于操作步驟繁復(fù)，透明用二甲苯試劑具較強(qiáng)致癌作用，而且脫水透蠟過(guò)程會(huì)讓枇杷成熟果肉這種富含水分的組織嚴(yán)重變形，影響對(duì)正常組織形態(tài)的觀察。3)超薄切片技術(shù)與透射電鏡相輔相成，從20世紀(jì)80年代即應(yīng)用于枇杷的各種亞顯微結(jié)構(gòu)的觀察，切片厚度在4種技術(shù)中最薄，因此結(jié)合電鏡能夠達(dá)到超高的分辨率；但該技術(shù)也有觀察范圍小、定位目的結(jié)構(gòu)難、難以連續(xù)成帶等缺點(diǎn)。4)冰凍切片技術(shù)在枇杷組織研究中的應(yīng)用目前依然很少，但其操作簡(jiǎn)便，成片后可與多種檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，因此預(yù)期其在枇杷研究中具備非常廣闊的應(yīng)用空間。4種技術(shù)均有各自的適用范圍，在枇杷的內(nèi)構(gòu)觀察研究中各具優(yōu)勢(shì)，研究者需根據(jù)研究目的和材料特點(diǎn)，選擇合適的切片技術(shù)或者結(jié)合應(yīng)用2種甚至3種切片技術(shù)，才能將它們更好地應(yīng)用于觀察枇杷內(nèi)構(gòu)，解決實(shí)際問(wèn)題，并推動(dòng)枇杷科研的發(fā)展。