吳錦程， 林授鍇， 吳畢莎， 林順權，3

(1.莆田學院 環(huán)境與生物工程學院，福建 莆田 351100；2.莆田學院 枇杷種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用福建省高校重點實驗室，福建 莆田 351100；3.華南農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，廣東 廣州 510642)

0 引言

基因組學(genomics)是一門進行生物基因組研究和利用的學科，通過分析基因組DNA序列或其表達產(chǎn)物等來解讀基因組信息。果樹基因組學研究是在人類、擬南芥、水稻等模式生物基因組計劃取得成功的基礎上開展起來的[1]。它的興起大大促進了相關果樹全基因組的獲取、果樹數(shù)據(jù)庫資源的構(gòu)建、果樹物種起源與演化、果樹功能基因的定位與克隆等方面的發(fā)展。本文綜述果樹基因組測序的歷史、基因組學在果樹的應用研究進程，最后進行了展望。

1 果樹基因組測序簡史

植物基因組學研究起源于1999年模式植物擬南芥核基因組2號和4號染色體的相繼測序，2000年12月擬南芥全部染色體被測序完成并發(fā)表[2]。2001年，人類基因組計劃公布了人類基因組草圖，為基因組學研究翻開了一個新的篇章；2002年水稻基因組測序完成，是第一個完成測序的作物基因組；最早進行基因組測序的果樹是葡萄，該項研究由法國和意大利科學家組成的團隊于2007年完成；2008年，明瑞光領導的小組完成了番木瓜的基因組測序[3]。隨后，越來越多的果樹基因組完成測序。由此，果樹迎來了基因組學時代。

果樹基因組研究的進展是與測序技術的進步緊密相關的。自Sanger法測序(也稱第一代測序技術)誕生以來，測序技術取得了革命性進展[4]。新產(chǎn)生的測序技術，根據(jù)出現(xiàn)時間、讀長和通量等特征，被稱作第二代、第三代測序技術等，也被統(tǒng)稱為新一代測序技術[5]。果樹中的葡萄、番木瓜和桃是采用Sanger法全基因組測序(即第一代測序技術)[6-8]。而蘋果、可可、香蕉、西瓜、甜橙等是采用第二代測序技術的[9-11]。杜梨、蘋果、枇杷等則是采用二代結(jié)合三代測序技術升級了基因組。其中蘋果的基因組序列最先于2010年發(fā)表，2016年利用二代和三代測序技術對蘋果基因組序列進行了更新，2017年又結(jié)合光學圖譜技術對蘋果基因組序列進行了再次更新[12-13]。

單子葉果樹被測序的有香蕉、菠蘿、椰子和棗椰樹等。薔薇科果樹被測序的種類最多，包括蘋果、甜櫻桃、桃、白梨、歐洲梨、黑樹莓、草莓及其近緣種、枇杷及其近緣種等[3，14]。中國科學家在果樹基因組測序中也作出了很大的貢獻，甜橙、梨、菠蘿、椰子、桑樹、獼猴桃、棗、榴蓮、石榴、楊梅、荔枝和枇杷等均是以我國科學家為主完成基因組測序[3，15-18]。

近年來，果樹的結(jié)構(gòu)基因組學和功能基因組學也取得一些重要進展[19]，許多新的技術(如Hi-C、Chicago、Linked-reads和光學圖譜等)被開發(fā)應用于基因組的輔助組裝，例如八倍體栽培草莓和枇杷(作者未發(fā)表資料)都是應用Hi-C技術將scaffold組裝到染色體水平[20]；榴蓮基因組先是利用Chicago技術組裝出高質(zhì)量的超長Scaffold，隨后結(jié)合Hi-C技術將超長Scaffold組裝到染色體水平。在功能基因定位方法上，采用從上而下的方法，通過表型差異來找到對應的突變基因并揭示其功能，包括連鎖分析、全基因組關聯(lián)分析等，如在番茄中分析定位粉果果皮顏色的關鍵位點[21]。

2 果樹基因組測序的基本信息

筆者初步統(tǒng)計，截至2020年4月，至少已有175個科255種園藝植物被測序，這些園藝植物包括93種果樹或砧木及其近緣種，其中72種果樹的基因組基本信息見表1。

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注:表1中的果樹主要指栽培果樹或水果(如西瓜、甜瓜、番茄、草莓、菠蘿等)，也包括部分野生果樹和砧木。統(tǒng)計截止時間為2020年4月。篇幅所限，本表未能盡列參考文獻，只能選一，且未能全部列入篇末的參考文獻表里。

隨著全基因組測序技術的持續(xù)發(fā)展，通過測序獲得了越來越多果樹的全基因組序列，積累了大量的基因組數(shù)據(jù)；同時，果樹的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組、表型組等大量生物信息數(shù)據(jù)也在不斷增長。因此，構(gòu)建了許多果樹的科屬或物種數(shù)據(jù)庫，可以對獲得的大量數(shù)據(jù)進行分析、貯存、整合以及傳播，為果樹基礎研究和應用研究提供實用生物數(shù)據(jù)[22]。部分果樹科屬和物種基因組數(shù)據(jù)庫見表2。

表2 部分果樹科屬和物種基因組數(shù)據(jù)庫

3 基因組學在果樹上的應用研究

3.1 利用全基因組測序研究物種起源與演化

3.1.1 物種起源進化

大多數(shù)植物在進化過程中經(jīng)歷了全基因組復制事件，它是植物重要的進化動力。全基因組復制事件根據(jù)發(fā)生時間可以分為古老和近代兩大類[23]。通過全基因組復制使得物種全基因組多倍化的方式包括全基因組倍增(genome duplication)和全基因組三倍化(genome triplication)[22]。香蕉屬于單子葉植物，發(fā)生過3次全基因組倍增事件，其基因組測序進一步闡明了單子葉植物的系統(tǒng)發(fā)育關系[7，24]。對芒果全基因組的分析，鑒定到一個發(fā)生于3 300萬年前的近代全基因組倍增事件[25]。葡萄基因組分析表明，葡萄祖先物種可能存在一個基因組古三倍化事件(γ)，使祖先二倍體進化成六倍體；進一步分析表明，該古三倍化事件發(fā)生的時間在單子葉和雙子葉分化之后，真雙子葉植物共同經(jīng)歷了該古三倍化事件。薔薇科果樹梨、蘋果和草莓的祖先種也經(jīng)歷了該古三倍化事件(γ)。此外，梨和蘋果的祖先還經(jīng)歷了一次近代全基因組倍增事件，推測時間在4 500萬～3 000萬年前。二者的分化時間出現(xiàn)在2 150萬～540萬年前[26]。

3.1.2 物種演化進程

基于基因組重測序分析發(fā)現(xiàn)，哈薩克斯坦的中亞野蘋果(Malus sieversii)先被馴化，而后馴化的蘋果與歐洲野蘋果(M.sylvestris)的雜交種通過絲綢之路從中亞向西傳播至歐洲；而哈薩克斯坦的中亞野蘋果與山荊子(M.baccata)雜交種沿絲綢之路向東傳播[27]?；蚪M重測序分析表明，梨資源可以分為亞洲梨和歐洲梨兩大類，亞洲梨具有較高的遺傳多樣性，而歐洲梨遺傳背景相對簡單。亞洲梨和歐洲梨分化于660萬～330萬年前，之后二者分別獨立馴化。目前公認的栽培梨由三種野生梨馴化而來。梨的馴化和傳播路徑為:梨起源于中國西南部，后經(jīng)過中亞地區(qū)傳播至西亞和歐洲[28]。在甜橙(Citrus sinensis)的起源分析中，利用甜橙、橘(C.reticulata)和柚(C.grandis)的全基因組數(shù)據(jù)，推測橘和柚對甜橙起源的貢獻基本上符合3∶1的關系；進一步選擇橘、柚和甜橙各3種類型進行基因組重測序分析，利用全基因組序列信息進一步證實橘和柚的貢獻比例符合3∶1關系，結(jié)合葉綠體基因組信息，推測甜橙起源模型為:甜橙=(柚×橘1)×橘2[11，29]，如圖1(引自文[11]，有修改)。通過基因組學、系統(tǒng)發(fā)生及生物地理學技術分析，發(fā)現(xiàn)柑橘屬物種多樣化首次發(fā)生在800萬～600萬年前的中新世晚期，并隨著亞洲季風減弱在東南亞地區(qū)迅速輻射進化；而在400萬年前的上新世，柑橘屬植物越過華萊士線從東南亞地區(qū)遷移到大洋洲導致了第二次輻射進化[30]。

圖1 甜橙起源的模型

3.2 果樹若干特征性狀功能基因研究

3.2.1 開花與生殖

(1)開花性狀

Soyk等應用QTL-seq技術定位到兩個番茄光周期反應的主效QTL，結(jié)合基因表達水平鎖定了候選功能基因SP5G，CRISPR/Cas9編輯的SP5G突變番茄植株能迅速開花，番茄植株的緊湊型生長習性也得到增強，表明SP5G是調(diào)控番茄日照長度敏感性的關鍵基因[31]。Jia等通過楊梅全基因組測序、混池分離分析和個體重測序分析等，發(fā)現(xiàn)了一段雌性楊梅樹特異的花性別決定區(qū)(FSR)，該59 kb大小的染色體區(qū)域包含了多個與性花發(fā)育有關的基因，其基因表達水平受環(huán)境因素調(diào)控，會導致部分雌性楊梅樹枝條開雄花[32]。

(2)生殖性狀

在梨的基因組研究中發(fā)現(xiàn)，6個S-haplotype specific F-box(SFB)基因表現(xiàn)出串聯(lián)重復，而且這些序列位于高度重復序列區(qū)，在一定程度上抑制了S位點的重組，這些基因組機制有可能與其自交不親和性相關[26]。梨重測序研究發(fā)現(xiàn)，梨通過S-RNase基因的快速進化和平衡選擇來保持自交不親和性，從而促進梨的異交和解釋梨橫跨歐亞大陸的基因組多樣性[28]。柑橘進化過程中在生殖上表現(xiàn)出了另一種現(xiàn)象——無融合生殖，以柑橘原始種、野生種和栽培種的基因組為基礎，Wang等采用比較基因組、遺傳學和基因表達分析方法解析了柑橘無融合生殖的分子基礎，設計了“基因組+群體”及“目的區(qū)域精細關聯(lián)”的策略鎖定了控制柑橘多胚的關鍵基因CitRWP[21]。

3.2.2 果實性狀

(1)果實大小與色澤

果實大小與產(chǎn)量息息相關，是人工選擇的主要靶向性狀之一。Yuste-Lisbona等通過全基因組測序作圖結(jié)合CRISPER/Cas9技術分離出一個AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子ENO，ENO基因突變會導致植物由于花分生組織的增大而產(chǎn)生更大的多室果實，在長期馴化過程中，ENO基因啟動子突變被正向選擇所靶向，為現(xiàn)代番茄果實大小的顯著增加奠定了基礎[33]。Zhang等通過分析發(fā)現(xiàn)蘋果花青素生物合成的核心轉(zhuǎn)錄激活因子MdMYB1基因上游的Gypsy-like反轉(zhuǎn)座子redTE插入可以充當增強子調(diào)控蘋果紅皮表型[34]。不易著色的蘋果品種因為缺少這一增強子而無法有效合成花青素。

(2)果實風味

Battilana等利用QTL分析與候選基因方法，鑒定了控制葡萄香氣形成的關鍵遺傳因子，最終在葡萄10號連鎖群上控制芳樟醇含量QTL區(qū)域定位到兩個香氣候選基因，還有一個候選基因1-脫氧-d-木酮糖5-磷酸鹽(1-deoxy-d-xylulose5-phosphate)合酶基因定位在5號連鎖群上控制單萜含量的主效QTL區(qū)域[35]。Zhu等從油柿基因組中鑒定了57個參與原花青素代謝的基因，其中33.96%的基因以基因簇的形式聚集在第一染色體上，這對油柿果實發(fā)育過程中原花青素大量積累導致澀味形成十分重要[36]。

(3)果實硬度

Hu等結(jié)合QTL定位和GWAS分析發(fā)現(xiàn)蘋果ERF4基因的EAR基序發(fā)生了一個突變(C-G)，導致其對ERF3基因表達抑制降低，進而促進蘋果果實乙烯的產(chǎn)生和硬度的降低[37]。Feng等通過對番石榴全基因組的選擇分析和基因表達分析，發(fā)現(xiàn)番石榴的淀粉代謝基因受到正向選擇，大多數(shù)淀粉降解相關基因在番石榴果實發(fā)育過程中表達增加[38]。除細胞壁降解外，淀粉降解可能是導致桃金娘科肉質(zhì)果實軟化的主要原因。

(4)果實營養(yǎng)

通過對甜橙4條維生素C調(diào)控途徑的基因表達以及基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，甜橙果實內(nèi)大量合成維生素C的關鍵途徑是半乳糖醛酸酯途徑，半乳糖醛酸還原酶基因(GalUR)扮演著關鍵因子的角色，該基因家族的擴增、快速進化、功能分化以及組織特異表達等可能與甜橙果實大量合成維生素C有關[11]。對棗樹基因組研究發(fā)現(xiàn)，棗果同時具有兩種積累維生素C的方式，一種與柑橘類似，大幅度加強了L-半乳糖合成維生素C的途徑，另一種與獼猴桃類似，維生素C再生途徑中的關鍵基因家族單脫氫抗壞血酸還原酶家族出現(xiàn)極顯著擴張[39]。

3.2.3 抗逆和次生代謝物質(zhì)合成

(1)抗逆性

Guan等通過分析銀杏全基因組序列，發(fā)現(xiàn)銀杏樹中提供各種防御機制的基因家族有廣泛擴增現(xiàn)象，特別是能夠抵抗病原體的基因有大量復制，使得銀杏具有多重的化學和抗菌防御途徑[40]。Dong等在杜梨的全基因組序列中鑒定了573個NBS型抗性基因類似物(RGAs)，其中有150個為TIR-NBS-LRR(TNL)型抗性基因，是已獲得全基因組序列的薔薇科植物中含TNL型抗性基因數(shù)量最多的，解釋了該野生種具有強抗病性的原因[41]。

(2)次生代謝物質(zhì)合成

Su等(私人通訊)通過比較基因組分析枇杷、美吐根、蘋果、梨等近緣物種基因組發(fā)現(xiàn)，枇杷三萜酸合成的OSC等幾個關鍵步驟酶基因，在全基因組復制后均得以保留并活躍表達，表達分析發(fā)現(xiàn)OSC基因與后續(xù)催化步驟的酶基因在組織中具有共表達趨勢，使得枇杷葉片中大量富集熊果酸和科羅索酸等三萜酸。

4 展望

從前述的進展中不難看出，主要的果樹科屬是基因組研究進展較快的，突出的例子包括薔薇科中的蘋果和梨等多種果樹、蕓香科中的多種柑橘類果樹；此外，葡萄科和芭蕉科也受到重視，得到較好的發(fā)展。其他一些較重要的果樹所屬科也占有一席之地。例外的是桃金娘科，該科內(nèi)有多種果樹，只測序了番石榴[38]，而蒲桃、蓮霧等都未見測序的報道。這些果樹多數(shù)在熱帶、南亞熱帶地區(qū)栽培，或許與這些地區(qū)科研基礎和經(jīng)濟實力有關。但是，隨著測序技術的高速發(fā)展和測序成本的大幅降低，以及果樹基因組學研究的進展，相信很快將會有更多的高質(zhì)量果樹基因組完成測序。

截至目前為止，果樹功能基因組學的進展遠遠落后于水稻、玉米等大田作物(小麥受困于復雜的倍性)，更不要說模式植物擬南芥等，這顯然與兩個原因有關:一是果樹是多年生的植物，多數(shù)還是木本植物，有性生殖周期很長，建立一個雜交后代群體到開花結(jié)果要多年時間；二是多數(shù)果樹受體系統(tǒng)的再生體系尚未建立起來，使得功能基因的定位、候選基因功能分析以及基因功能的驗證都嚴重受阻。對于果樹來說，除了充分借助模式植物上的可行辦法外，已經(jīng)在果樹等木本植物自身上獲得的成功實例，都將迅速被應用到其他果樹上。

另一方面，植物上重要的生物學問題，開花、結(jié)實和世代繁衍問題，僅依靠擬南芥和水稻等一年生植物(甚至一年可以繁殖多代)是不夠的，尤其是結(jié)實方面的問題，反而有可能在果樹上先獲得某一方面的突破。因為，果樹的結(jié)實方式豐富多彩，多樣性程度高，這是一年生植物所無法比擬的。因此，果樹學的研究者應當加倍努力，果樹基因組學研究的前景是非常光明的，盡管困難很多很大。