段昆茂，王世芳△，陳周紅

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院產(chǎn)科，重慶 401420； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 401120

子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種特殊類型，一般表現(xiàn)為妊娠女性在妊娠20周以后出現(xiàn)水腫、蛋白尿、高血壓，在分娩以后血壓恢復(fù)正常[1]。目前尚不清楚子癇前期的具體發(fā)病機(jī)制和病因，已知滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤的主要組成部分，在胎盤形成和胎兒正常發(fā)育過程中具有重要作用，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮螺旋動(dòng)脈受限和過淺均可能夠誘導(dǎo)子癇前期的發(fā)生，改善滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力可能是抑制子癇前期的重要步驟[2]。微小RNA(miRNA)是一類沒有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，可以通過與靶基因的3端非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合影響蛋白翻譯[3]。miRNA的功能很多，如調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、炎癥、衰老、氧化損傷、增殖等，還與很多疾病的發(fā)生有關(guān)[4]。既往研究顯示，子癇前期患者胎盤組織中miRNA表達(dá)異常，且影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能[5]。miR-663是與腫瘤有關(guān)的調(diào)控因子，還與鼻息肉的產(chǎn)生、燙傷修復(fù)等過程密切相關(guān)[6-8]。研究顯示，miR-663在子癇前期患者中高表達(dá)[9]。目前尚不清楚miR-663在妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-663和基質(zhì)金屬蛋白酶11(MMP11)的3′UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，MMP11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲過程中發(fā)揮促進(jìn)作用[10]。本研究通過探討miR-663調(diào)控MMP11對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲的影響及機(jī)制，以期為改善子癇前期的預(yù)后提供方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年7月至2020年7月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院收治的妊娠期子癇前期患者行剖宮產(chǎn)留取的胎盤組織19例，同時(shí)收集健康妊娠女性行剖宮產(chǎn)留取的胎盤組織19例(對(duì)照組織)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 妊娠滋養(yǎng)層JEG-3細(xì)胞購(gòu)自上海通派生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液、CCK-8、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；miR-663 模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-663)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)及抑制劑對(duì)照序列(anti-miR-NC)由上海安必奇生物科技有限公司構(gòu)建；MMP11過表達(dá)載體及其小干擾RNA(si-MMP11)、空載體(vector)、小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、MMP11野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體均由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建；MMP11、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自上海齊一生物科技有限公司。

1.2.2miR-663和MMP11 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR檢測(cè)miR-663和MMP11 mRNA表達(dá)水平。采用Trizol試劑提取子癇前期患者胎盤組織和對(duì)照組織中的總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA水平和純度。然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct法分析目的基因的表達(dá)變化，miR-663內(nèi)參為U6，MMP11 mRNA內(nèi)參為GAPDH。PCR引物為：U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′；miR-663上游引物5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，下游引物5′-TTTAGGCGGGGCG-3′；MMP11上游引物5′-TTCTACACCTTCCGCTACC-3′，下游引物5′-GGACTGGCTTCTCACCATCATAT-3′；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 復(fù)蘇JEG-3細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將2.5 mL對(duì)數(shù)期JEG-3細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種至6孔板中，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、anti-miR-663(anti-miR-663組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-663 mimics(miR-663組)、Vector(Vector組)、MMP11過表達(dá)載體(MMP11組)，共轉(zhuǎn)染anti-miR-663與si-NC(anti-miR-663+si-NC組)、anti-miR-663與si-MMP11(anti-miR-663+si-MMP11組)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(Control組)：不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，采用qRT-PCR檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組和anti-miR-663組miR-663表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，具體方法同1.2.2；采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、miR-NC組和miR-663組細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平，觀察miR-663對(duì)細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平的影響，同時(shí)檢測(cè)Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組、anti-miR-663+si-MMP11組MMP11蛋白表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細(xì)胞增殖情況。將0.2 mL各組細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μL CCK-8。孵育3 h，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處吸光度(A)值。

1.2.5細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè) 利用孔徑為8 μm的Transwell小室測(cè)定Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細(xì)胞遷移及侵襲情況。侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先在Transwell小室的上室添加人工基質(zhì)膠，自然晾干。然后于上室加100 μL各組細(xì)胞懸液(5.0×104個(gè)/毫升)，下室中添加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱中孵育24 h，將Transwell小室取出，擦掉沒有穿膜的細(xì)胞，放在4%多聚甲醛溶液中固定10 min，將小室取出，風(fēng)干后進(jìn)行蘇木精染色。選擇4個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn)：除不鋪基質(zhì)膠外，步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.6靶向關(guān)系預(yù)測(cè)及鑒定 采用生物信息學(xué)軟件targetscan分析miR-663的靶基因。以熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。將miR-663 mimics、miR-NC分別和WT、MUT熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染到JEG-3細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用熒光素酶活性測(cè)定試劑盒分析細(xì)胞熒光素酶活性變化。

1.2.7MMP11蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平。將2.5 mL各組細(xì)胞(5.0×104個(gè)/毫升)接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白表達(dá)水平。用微量加樣器取25 μg的蛋白樣品分別加入SDS-PAGE凝膠樣品孔內(nèi)，接通電源。前30 min，以70 V的電壓電泳，然后調(diào)整為100 V繼續(xù)電泳約1.5 h，肉眼可見藍(lán)色染料進(jìn)入到底部邊緣。取出凝膠，放在電轉(zhuǎn)液內(nèi)結(jié)合15 min。設(shè)置100 V的電壓轉(zhuǎn)膜1 h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并浸泡在含有5%脫脂奶粉的平皿內(nèi)，在室溫孵育2 h。然后放在MMP11(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗溶液中于4 ℃冰箱中孵育過夜，洗膜后，再放在二抗(1∶2 000)溶液中室溫孵育2 h。滴加顯影液避光顯影，曝光拍照，分析條帶灰度值。以MMP11與GAPDH灰度值的比值表示MMP11蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1子癇前期患者胎盤組織和對(duì)照組織中miR-663表達(dá)水平比較 與對(duì)照組織比較，子癇前期患者胎盤組織中miR-663表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-663在子癇前期患者胎盤組織中呈高表達(dá)，見圖1。

注：與對(duì)照組織比較，*P<0.05。

2.2miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平比較 與Control、anti-miR-NC組比較，anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平降低(P<0.05)，見表1。

表1 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平比較

2.3下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與Control、anti-miR-NC組比較，anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖活性升高，遷移和侵襲數(shù)目增加(P<0.05)。下調(diào)miR-663能促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。見表2。

表2 下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4miR-663與MMP11的關(guān)系 生物信息學(xué)軟件顯示miR-663和MMP11存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2，提示miR-663和MMP11為靶向關(guān)系。與miR-NC組比較，miR-663 mimics和WT共轉(zhuǎn)染后的妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，見表3。

圖2 miR-663和MMP11結(jié)合位點(diǎn)

表3 miR-663 mimics和MUT、WT共轉(zhuǎn)染后的妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光素酶活性比較

2.5miR-663對(duì)MMP11表達(dá)的調(diào)控作用 與Control、anti-miR-NC組比較，anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示miR-663負(fù)調(diào)控MMP11表達(dá)。見圖3、表4。

表4 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平比較

圖3 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)情況

2.6子癇前期患者胎盤組織和對(duì)照組織中MMP11 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組織比較，子癇前期患者胎盤組織MMP11 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示MMP11 mRNA在子癇前期患者中表達(dá)下調(diào)。見圖4。

注：與對(duì)照組織比較，*P<0.05。

2.7抑制MMP11逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-663對(duì)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與Control、Vector組比較，MMP11組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平升高，增殖活性升高，侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目增加(P<0.05)。與anti-miR-663+si-NC組比較，anti-miR-663+si-MMP11組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)水平降低，增殖活性降低，侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目減少(P<0.05)。見圖5、表5。

圖5 Western blot檢測(cè)妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP11蛋白表達(dá)

表5 各組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP11蛋白表達(dá)水平、增殖活性(A值)、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目比較

續(xù)表5 各組妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP11蛋白表達(dá)水平、增殖活性(A值)、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目比較

3 討 論

胚胎發(fā)育與功能性胎盤的形成有關(guān)，囊胚期的胚胎細(xì)胞分化形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化形成胎兒，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分化形成不同的滋養(yǎng)層細(xì)胞，滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷增殖分化，最終形成具有侵襲能力的多層絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲至子宮蛻膜，進(jìn)入母體的螺旋動(dòng)脈，維持子宮正常功能，為胚胎發(fā)育提供有利條件[11-12]。研究顯示，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移受限是子癇前期發(fā)生的關(guān)鍵原因[13]。

miRNA是一類長(zhǎng)度在22 nt左右的非編碼RNA分子，這類分子可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其靶基因的表達(dá)[14]。miRNA在進(jìn)化上極為保守，在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)豐度不同[15]。miRNA的異常表達(dá)常常與疾病有關(guān)，如miRNA在腫瘤中可發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用，通過影響細(xì)胞的增殖、凋亡等發(fā)揮作用[16]?，F(xiàn)階段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)miRNA，影響人體內(nèi)30%的基因表達(dá)，在生命進(jìn)程中發(fā)揮十分重要的作用[17]。miRNA在子癇前期中可通過調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮作用[18]。既往研究表明，子癇前期患者胎盤組織中miR-663表達(dá)水平升高，提示miR-663可能參與子癇前期的發(fā)病過程[9]。本研究結(jié)果顯示，miR-663在子癇前期患者中表達(dá)水平升高，并且下調(diào)miR-663可加快滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和侵襲，miR-663可能具有加快子癇前期進(jìn)展的作用。

miRNA的功能多樣性與其調(diào)控機(jī)制有關(guān)，miRNA與靶基因的3′UTR端通過堿基互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而影響靶蛋白的表達(dá)，并且同一個(gè)miRNA可同時(shí)有多個(gè)靶基因，分別參與不同的生理、病理調(diào)控過程[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-663與MMP11的3′UTR端互補(bǔ)結(jié)合，并且miR-663靶向負(fù)調(diào)控MMP11表達(dá)。MMP11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，而基質(zhì)金屬蛋白酶家族是細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白酶[21-22]。細(xì)胞合成的基質(zhì)降解酶能夠?yàn)榧?xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲提供條件[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期胎盤組織中MMP11表達(dá)水平降低，并且上調(diào)MMP11可增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力，提示MMP11在子癇前期中可能發(fā)揮抑制作用。同時(shí)本研究還設(shè)置了逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，證明抑制MMP11逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-663對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移和增殖的促進(jìn)作用，這進(jìn)一步說明下調(diào)miR-663可使MMP11的表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖，miR-663在子癇前期中的作用機(jī)制可能與MMP11有關(guān)。

綜上所述，miR-663可能具有促進(jìn)子癇前期發(fā)展的作用，并且下調(diào)miR-663可靶向促進(jìn)MMP11增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力，目前尚不明確miR-663是否能通過其他途徑影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲，這些內(nèi)容會(huì)在以后的研究中進(jìn)一步探討。本研究為明確子癇前期的分子發(fā)生機(jī)制和靶向基因治療子癇前期提供了思路。