孔評(píng)石,陳美云，滕鳳猛

江蘇省第二中醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.腫瘤科,江蘇南京 210017；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210004

隨著近年來免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICB)療法在腫瘤治療中取得的巨大進(jìn)步，程序性死亡受體-1(PD-1)和程序性死亡配體-1(PD-L1)等免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)特征在臨床治療中的預(yù)測(cè)價(jià)值備受關(guān)注，病理組織中PD-1和PD-L1的表達(dá)水平聯(lián)合其他指標(biāo)的預(yù)測(cè)模式正在逐步建立。可溶性程序性死亡受體-1(sPD-1)和可溶性程序性死亡配體-1(sPD-L1)是PD-1和PD-L1的可溶性形式，與細(xì)胞膜型分子聯(lián)系密切，在免疫平衡中發(fā)揮重要作用，對(duì)判斷機(jī)體免疫狀態(tài)、預(yù)測(cè)免疫治療療效和腫瘤轉(zhuǎn)歸具有潛在的重要價(jià)值，并且因PD-1/PD-L1通路在免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的免疫抑制中的關(guān)鍵性和廣泛性作用而越發(fā)受到關(guān)注；然而sPD-1和sPD-L1在外周循環(huán)中的表達(dá)特征和表達(dá)水平仍缺乏更廣泛的數(shù)據(jù)支持，國內(nèi)的研究也相對(duì)較少。γ-干擾素(IFN-γ)在調(diào)控PD-L1中具有重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ聯(lián)合PD-L1能夠?qū)δ[瘤微環(huán)境的不同免疫特征進(jìn)行有效劃分，并具有一定的治療預(yù)測(cè)價(jià)值[1]，然而二者在外周血中同步觀察的數(shù)據(jù)較少。本研究擬以健康人和良性疾病患者為對(duì)照，對(duì)晚期惡性實(shí)體腫瘤(包括肺癌和消化道腫瘤)患者血清sPD-1和sPD-L1的水平進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)分析其與IFN-γ及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性，旨在對(duì)腫瘤免疫中外周血可溶性免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)特征和臨床意義進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究納入2020年5—7月江蘇省第二中醫(yī)院(簡稱本院)腫瘤科收治的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者21例(肺癌組)，男13例，女8例，年齡55～80歲，平均(67.1±6.7)歲；消化道腫瘤患者13例(消化道腫瘤組)，男8例，女5例，年齡58～82歲，平均(67.8±7.0)歲，包括胃癌3例，胰腺癌2例，食管癌2例，結(jié)腸癌6例。納入病例均經(jīng)過病理檢查或細(xì)胞學(xué)檢查確診，既往進(jìn)行過化療且未進(jìn)行過免疫治療，TNM分期為Ⅲb～Ⅳ期，分別符合《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2018版)》《食管癌診療規(guī)范(2018版)》《胃癌診療規(guī)范(2018版)》《胰腺癌診療規(guī)范(2018版)》《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選取同期本院呼吸科住院的肺部良性疾病患者16例(肺炎組)及體檢健康者12例(體檢組)作為對(duì)照，肺炎組男9例，女7例，年齡51～77歲，平均(64.8±8.3)歲；體檢組男6例，女6例，年齡40～74歲，平均(54.7±12.3)歲。各組人群性別及年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。排除自身免疫性疾病和結(jié)核、梅毒、病毒性肝炎等傳染性疾病及器官功能嚴(yán)重受損者。

1.2方法 受試者常規(guī)空腹抽取靜脈血，離心分離血清。甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原153(CA153)、糖類抗原199(CA199)、糖類抗原724(CA724)、細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra211)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；sPD-1、sPD-L1和IFN-γ檢測(cè)分別按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書操作，檢測(cè)信號(hào)波長：450 nm，矯正波長：570 nm；采用雙抗體夾心法，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用四參數(shù)擬合。上述腫瘤標(biāo)志物采用Roche公司Cobas e602電化學(xué)發(fā)光分析儀和配套Elecsys試劑檢測(cè)；免疫標(biāo)志物sPD-1、sPD-L1和IFN-γ采Thermo公司Multiskan FC酶標(biāo)儀檢測(cè)，試劑盒為上海愛必信公司產(chǎn)品。

2 結(jié) 果

2.1各組腫瘤標(biāo)志物水平比較 消化道腫瘤組CEA為18.35 (6.12,112.05)ng/mL，肺癌組CEA 為9.46(2.89,194.65)ng/mL，均高于肺炎組的1.73(1.48,3.56)ng/mL和體檢組的1.46(1.27,1.92)ng/mL(P<0.01)；消化道腫瘤組CA125為95.15(14.17,424.15)U/mL，高于肺炎組的14.11(5.96,34.56)U/mL(P<0.05)；肺癌組CA153為13.17(8.27,25.58)U/mL，高于肺炎組的5.18(3.74,10.24)U/mL(P<0.05)；消化道腫瘤組CA199為244.30(26.99,1 000.00) U/mL，高于體檢組的8.05(6.35,12.82)U/mL(P<0.01)；消化道腫瘤組CA724為7.03 (2.38,15.56)U/mL，高于肺炎組的1.54(0.77,3.11)U/mL(P<0.05)；肺癌組Cyfra211為5.54(3.94,30.40)ng/mL，消化道腫瘤組Cyfra211為10.40 (5.27,108.65)ng/mL，均高于體檢組的2.09(1.17,2.72)ng/mL和肺炎組的1.47(1.20,3.62)ng/mL(P<0.01)；肺癌組NSE為17.10(12.01,34.87)ng/mL，高于體檢組的11.14(9.41,12.99)ng/mL(P<0.05)。見圖1。

注：與體檢組比較，△P<0.01；與肺炎組比較，▲P<0.01；與體檢組比較，*P<0.05；與肺炎組比較，#P<0.05。

2.2各組免疫指標(biāo)水平比較 腫瘤患者的sPD-1和sPD-L1水平有升高的趨勢(shì)，其中消化道腫瘤組sPD-1為480.51 (235.34,4 745.00)pg/mL，顯著高于體檢組的182.13(104.79,320.37)pg/mL(P<0.05)，sPD-L1/IFN-γ為27.32(5.15,194.01)，高于肺炎組的5.39(2.99,7.48)(P<0.01)；各組IFN-γ水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：與體檢組比較，*P<0.05；與肺炎組比較，▲P<0.01。

2.3不同水平腫瘤標(biāo)志物和IFN-γ對(duì)sPD-1、sPD-L1的影響 34例腫瘤患者并非進(jìn)行所有腫瘤標(biāo)志物和免疫標(biāo)志物的檢測(cè)，其中CA125/CA153/CA724/Cyfra211各有2例患者未做檢測(cè)因而未納入統(tǒng)計(jì)。以腫瘤患者各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物和IFN-γ水平中位數(shù)作為界值將其分為高水平和低水平，分析同水平腫瘤標(biāo)志物和IFN-γ對(duì)sPD-1和sPD-L1表達(dá)高低的影響，結(jié)果顯示僅IFN-γ水平對(duì)sPD-1和sPD-L1水平有影響(P<0.01)。見表1。

表1 不同水平腫瘤標(biāo)志物和IFN-γ對(duì)sPD-1、sPD-L1的影響(n)

2.4各項(xiàng)免疫指標(biāo)的相關(guān)性分析 在肺癌組、消化道腫瘤組及所有腫瘤患者中，sPD-1和sPD-L1呈正相關(guān)；在肺炎組中，IFN-γ與sPD-L1呈正相關(guān)。見圖3。

注：A為肺癌組；B為消化道腫瘤組；C為肺癌組+消化道腫瘤組；D為肺炎組。

3 討 論

近年來隨著腫瘤免疫調(diào)控機(jī)制的逐漸清晰，PD-1/PD-L1作為新興的生物標(biāo)志物，其作用和價(jià)值在抗腫瘤療效預(yù)測(cè)、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估中得到迅速拓展[2]。PD-1作為共抑制分子廣泛表達(dá)于T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面，在免疫平衡中發(fā)揮重要作用。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)持續(xù)高表達(dá)的PD-1被認(rèn)為是T細(xì)胞耗竭的重要標(biāo)志之一，在多種腫瘤的治療中顯示出一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)也是目前ICB療法最集中的抑制靶點(diǎn)[3]。PD-L1是PD-1的配體，組成性表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，在激發(fā)后其表達(dá)上調(diào)。多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中抗原呈遞細(xì)胞亦高表達(dá)PD-L1，其與TIL上的PD-1結(jié)合，激活PD-1/PD-L1通路引起T細(xì)胞內(nèi)一系列事件，最終導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭、凋亡和腫瘤免疫耐受[4]。PD-L1在腫瘤組織中的表達(dá)水平是基于PD-1/PD-L1通路的多種ICB療法的重要療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，近年來在腫瘤免疫治療中得到了充分的發(fā)掘，PD-L1及其聯(lián)合TIL浸潤程度、IFN-γ共表達(dá)以及T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)等其他免疫檢查點(diǎn)分子的共表達(dá)等特征成為評(píng)價(jià)TIL狀態(tài)、劃分腫瘤微環(huán)境免疫類型、選擇合適療法、預(yù)判獲益人群以及預(yù)后評(píng)估的重要工具[4]。

sPD-1是PD-1的可溶性形式，近年來發(fā)現(xiàn)其具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。sPD-1是全長PD-1(flPD-1)mRNA剪接體的翻譯產(chǎn)物之一，能與PD-L1結(jié)合從而阻斷其與膜型PD-1(mPD-1)結(jié)合，具有抵抗T細(xì)胞抑制的功能；sPD-1能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟從而提高T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。腫瘤特異性T細(xì)胞是sPD-1的主要來源，多種腫瘤患者sPD-1水平升高，提示其具有腫瘤生物標(biāo)志物的潛能。有研究表明，sPD-1在肝癌、胰腺癌、晚期食管癌等多種腫瘤治療前的高表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度、臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)[5-7]。在乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)的肝細(xì)胞癌(HCC)中，通過評(píng)估sPD-1水平對(duì)HBV載量和HCC風(fēng)險(xiǎn)的影響發(fā)現(xiàn)，sPD-1水平升高的縱向效應(yīng)有助于維持長期較高的病毒載量，并且與肝癌風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，sPD-1水平的穩(wěn)定或升高與肝癌手術(shù)、鼻咽癌放療和肺癌的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)治療的預(yù)后改善有關(guān)[9-11]。經(jīng)EGFR-TKIs治療的NSCLC患者sPD-1水平升高，與無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期(OS)的提高有關(guān)；使用PD-1單抗治療后，sPD-1水平穩(wěn)定或升高的NSCLC患者PFS和OS也得到改善[12]，可能提示sPD-1對(duì)免疫抑制的抵抗能引起腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞再激活。

sPD-L1是PD-L1的可溶性形式，主要由膜型PD-L1(mPD-L1)經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)剪切產(chǎn)生，通過與PD-1特異性結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用。sPD-L1可從PD-L1陽性的腫瘤細(xì)胞中釋放，還來源于腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞、活化的DC等髓系細(xì)胞并受周圍細(xì)胞因子、炎癥環(huán)境等多因素調(diào)節(jié)。因此，sPD-L1水平是由患者的腫瘤負(fù)荷和腫瘤外炎性背景共同決定的。sPD-L1在多種腫瘤組織中表達(dá)，并已逐漸應(yīng)用于腫瘤患者的病理特征、治療反應(yīng)和生存結(jié)局的預(yù)測(cè)[13-15]。高水平sPD-L1與肺癌、肝癌預(yù)后不良相關(guān)[14-15]；sPD-L1還與肺癌的分期、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、腹部的臟器轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)[16]。病情緩解的患者sPD-L1水平呈下降趨勢(shì)，而病情進(jìn)展的患者sPD-L1水平呈上升趨勢(shì)，提示sPD-L1對(duì)PD-1陽性T細(xì)胞的抑制加強(qiáng)，有助于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸。患者sPD-L1水平越高，機(jī)體免疫抑制越嚴(yán)重，預(yù)后越差。然而，亦有研究發(fā)現(xiàn)，在晚期胃癌患者的預(yù)后評(píng)估中，高水平的sPD-L1與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，晚期胃腺癌患者sPD-L1水平越高，預(yù)后越好[17]。

sPD-1和sPD-L1可能在腫瘤的發(fā)病機(jī)制、免疫反應(yīng)和療效預(yù)測(cè)中發(fā)揮重要作用，但sPD-1/sPD-L1與腫瘤及mPD-1/mPD-L1之間的作用仍然十分復(fù)雜，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)尚不能提供一致的預(yù)測(cè)模式。

本研究發(fā)現(xiàn)，在晚期肺癌和消化道腫瘤患者中，sPD-1和sPD-L1整體呈高表達(dá)，消化道腫瘤組sPD-1水平顯著高于體檢組，sPD-L1水平也具有一定的升高趨勢(shì)；此外，肺癌組sPD-1、PD-L1和消化道腫瘤組sPD-1、sPD-L1水平范圍較廣，離散程度較大，推測(cè)一方面與患者病種和病理分型、分期的差異有關(guān)，另一方面也反映了腫瘤異質(zhì)性和不同個(gè)體免疫反應(yīng)強(qiáng)度的巨大差異。

本研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組、消化道腫瘤組及全部腫瘤患者中，sPD-1與sPD-L1均呈正相關(guān)。sPD-1/sPD-L1的同步升高提示它們?cè)诿庖咂胶庵忻芮新?lián)系以對(duì)抗彼此消長的影響，即腫瘤特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的sPD-1與癌細(xì)胞等分泌的sPD-L1維持一種有利于腫瘤細(xì)胞的免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)[18]，sPD-1提升對(duì)sPD-L1/mPD-1的抵抗作用以避免T細(xì)胞過度抑制；相反，sPD-L1的增加進(jìn)一步作用于mPD-1以加強(qiáng)T細(xì)胞抑制，增強(qiáng)腫瘤免疫逃避并導(dǎo)致不良預(yù)后。目前利用sPD-1緩解T細(xì)胞抑制的抗癌策略受到越來越多的關(guān)注，并在研究中顯示出巨大的潛力[19]。

IFN-γ是由活化T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等釋放的重要的抗腫瘤細(xì)胞因子,能夠通過激活酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT1)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面組織相容性復(fù)合體抗原分子的表達(dá)促進(jìn)殺傷性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別殺傷。同時(shí)IFN-γ也是PD-L1的最強(qiáng)誘導(dǎo)因素，在多種腫瘤中介導(dǎo)PD-L1上調(diào)進(jìn)而激活PD-L1/PD-1通路并抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答[20]。研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ與PD-L1雙陽性患者的腫瘤細(xì)胞對(duì)治療敏感，無病生存期較其他患者顯著延長。IFN-γ與PD-L1雙陽性的患者中，促進(jìn)腫瘤生長的細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著降低，因此IFN-γ和PD-L1雙陽性表達(dá)可作為PD-1/PD-L1阻斷治療有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)[1,20]。高密度TIL是多種腫瘤患者的有利預(yù)后因素，肺腺癌組織中IFN-γ的表達(dá)量與癌巢中TIL數(shù)目和PD-1的表達(dá)量均呈正相關(guān)，表明IFN-γ的表達(dá)水平可反映腫瘤微環(huán)境中免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱。

本研究未發(fā)現(xiàn)IFN-γ在腫瘤和肺炎患者呈明顯的高表達(dá)，然而在肺炎患者中IFN-γ與sPD-L1呈正相關(guān)，反映了炎癥環(huán)境中sPD-L1對(duì)IFN-γ促炎性的平衡作用。本研究中肺癌組和消化道腫瘤組sPD-L1/IFN-γ相對(duì)于肺炎組及體檢組有升高趨勢(shì)，并且消化道腫瘤組顯著高于肺炎組，可能提示IFN-γ對(duì)晚期腫瘤中sPD-L1的上調(diào)作用更為顯著，體現(xiàn)了腫瘤內(nèi)穩(wěn)狀態(tài)下外周循環(huán)中PD-L1的免疫抑制對(duì)IFN-γ的免疫促進(jìn)優(yōu)勢(shì)。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者中，不同IFN-γ水平的患者其sPD-1和sPD-L1分布有顯著差異，反映了不同個(gè)體的免疫反應(yīng)強(qiáng)度差異以及外周循環(huán)中IFN-γ/PD-L1/PD-1在參與腫瘤免疫調(diào)控中扮演著重要角色。本研究結(jié)果顯示，反映腫瘤負(fù)荷的傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物在腫瘤患者中多有不同程度的升高，但是與sPD-1/sPD-L1缺乏明顯的相關(guān)性。以往的證據(jù)表明，sPD-1/sPD-L1的高表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[16]，同時(shí)考慮到癌巢中TIL等免疫細(xì)胞密度以及mPD-1/mPD-L1表達(dá)的不同，晚期腫瘤患者外周循環(huán)sPD-1/sPD-L1水平整體呈高表達(dá)且又存在巨大個(gè)體差異的特征可能更具有劃分患瘤機(jī)體整體的細(xì)胞免疫狀態(tài)的潛在價(jià)值，進(jìn)而可能為ICB療法等免疫治療及其他抗腫瘤治療策略的選擇提供方向性的指導(dǎo)作用，有待今后的深入研究。

目前臨床常應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)局部腫瘤組織中PD-1/PD-L1的表達(dá)，需要通過侵入性手段獲取腫瘤組織，對(duì)于晚期非手術(shù)適應(yīng)患者尤其是轉(zhuǎn)移性腫瘤患者存在取材障礙的問題，并且組織樣本檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一，操作步驟復(fù)雜以及結(jié)果判定上存在主觀差異，結(jié)果的可重復(fù)性不夠理想，因此PD-1/PD-L1組織病理檢測(cè)難以成為廣泛適用的手段。而血清可溶性分子的檢測(cè)具有無創(chuàng)性取材、能夠動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察指標(biāo)變化的明顯優(yōu)勢(shì)，并且在一定程度上可均質(zhì)化腫瘤的異質(zhì)性和多發(fā)轉(zhuǎn)移性，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)相關(guān)指標(biāo)，更客觀地反映機(jī)體整體的腫瘤免疫狀態(tài)。sPD-1/sPD-L1的潛在應(yīng)用價(jià)值已越來越受到關(guān)注，本研究僅為針對(duì)臨床晚期腫瘤患者小樣本量的探索，不同實(shí)體瘤病種及分期、分型中sPD-1/sPD-L1表達(dá)變化以及更精準(zhǔn)的預(yù)后和治療預(yù)測(cè)價(jià)值有待研究的進(jìn)一步深入和拓展。