喬廣明，王志敏，張雪欣，時亞娟，齊曉玉，贠美玲，岳智杰

急性肺損傷是多種因素引起的急性彌漫性肺損傷，病情嚴重時可能會出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征[1]。急性肺損傷發(fā)病可能與細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等有關(guān)[2]。目前急性肺損傷的治療方式包括藥物治療、機械通氣，但病死率仍較高[3]。重組人粒細胞集落刺激因子是干細胞動員劑，能促進干細胞及造血祖細胞生長、分化和成熟，對干細胞移植具有重要作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，重組人粒細胞集落刺激因子能有效減緩肺損傷的炎癥反應(yīng)[5]。骨髓間充質(zhì)干細胞是一種多功能細胞，具備成骨細胞、神經(jīng)細胞等多種細胞的分化能力[6]。研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞移植能減緩急性肺損傷大鼠的炎癥反應(yīng)[7]。故本研究通過構(gòu)建急性肺損傷模型，探討重組人粒細胞刺激因子促進骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)急性肺損傷的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 重組人粒細胞刺激因子購自廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司；TUNEL試劑盒購自羅氏公司；p53抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細胞介素-1β(IL-1β)試劑盒、IL-10試劑盒購自R&D公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗動物和分組 實驗動物選擇清潔級BALB/C小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京華阜康生物公司，許可證號為SYXK(京)2014-0004。開始實驗前7 d，小鼠正常飲食和進水。

1.3骨髓間充質(zhì)干細胞制備 選擇5只小鼠稱取體質(zhì)量，然后腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉處死小鼠，無菌條件下取出小鼠脛骨、股骨，除去肌肉、結(jié)締組織等，取出骨髓用PBS液沖洗并制成細胞懸液，1000 r/min離心5 min，后放置在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與0.1 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，1×108/ml密度接種于25 cm2培養(yǎng)皿，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)至85%時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.4實驗分組和給藥 將60只BALB/C小鼠均分為對照組、模型組、治療組、干細胞組、聯(lián)合組。除對照組外均予腹腔內(nèi)注射5 mg/kg脂多糖建立急性肺損傷模型[8]，對照組注射等體積生理鹽水。造模成功24 h后，對小鼠進行不同處理，治療組：尾靜脈注射50 μg/kg重組人粒細胞刺激因子；干細胞組：尾靜脈注射1 ml骨髓間充質(zhì)干細胞懸液(3×106個)；聯(lián)合組：尾靜脈注射50 μg/kg重組人粒細胞刺激因子和1 ml骨髓間充質(zhì)干細胞懸液(3×106個)。各組治療72 h后，觀察小鼠精神狀態(tài)、呼吸、飲食和進水等一般情況。

1.5肺組織濕/干比測定 給藥72 h后，用3 mg/kg 10%水合氯醛麻醉小鼠，取出小鼠左肺組織使用濾紙吸干表面血液后稱重，然后在80 ℃烘箱內(nèi)停留24 h并稱重，計算二者比值。

1.6TUNEL檢測肺組織細胞凋亡情況 取出麻醉處死小鼠肺組織，用4%多聚甲醛固定12 h，脫水石蠟包埋切片，切片厚度約6 μm，嚴格參照TUNEL試劑盒說明書進行操作并觀察細胞凋亡情況。

1.7ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MDA水平 處死小鼠后取小鼠外周血2 ml，離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明書，檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MDA水平。

1.8Western blot法檢測肺組織p53、Bax、Bcl-2蛋白表達 取上述肺組織，加入蛋白裂解液后提取細胞蛋白，離心后采用BCA法進行蛋白定量。取蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的樣品轉(zhuǎn)移至膜上，經(jīng)脫脂奶粉封閉培養(yǎng)1 h，加入p53抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體于4 ℃孵育過夜，加入帶有標記的二抗，37 ℃孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液顯色，以GAPDH為內(nèi)參，收集圖像分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況 對照組小鼠精神狀態(tài)較好、正常飲食和進水，無死亡；模型組小鼠精神狀態(tài)較差、呼吸較為困難、飲食和進水減少，存活5只，存活率為41.7%；治療組、干細胞組和聯(lián)合組小鼠精神狀態(tài)、飲食和進水欠佳，分別存活9只、10只、11只，存活率分別為75.0%、83.3%、91.7%。

2.2各組肺組織濕/干比、細胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MDA水平比較 與對照組相比，模型組、治療組、干細胞組、聯(lián)合組肺組織濕/干比、細胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA水平明顯升高，SOD水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，治療組、干細胞組、聯(lián)合組肺組織濕/干比、細胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA水平明顯降低，SOD水平明顯升高(P<0.05)；與治療組、干細胞組相比，聯(lián)合組肺組織濕/干比、細胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA明顯降低，SOD明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺組織濕/干比、細胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、SOD、MDA水平比較

2.3各組小鼠肺組織p53、Bax、Bcl-2蛋白表達比較 與對照組相比，模型組、治療組、干細胞組、聯(lián)合組p53、Bax蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，治療組、干細胞組、聯(lián)合組p53、Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與治療組、干細胞組相比，聯(lián)合組p53、Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 各組小鼠肺組織p53、Bax、Bcl-2蛋白表達

表2 各組小鼠肺組織p53、Bax、Bcl-2蛋白表達比較

3 討論

脂多糖是建立急性肺損傷動物模型的關(guān)鍵誘因，能促進肺組織活性氧產(chǎn)生大量細胞因子，造成肺組織損傷[9]。本研究采用脂多糖建立急性肺損傷動物模型，且其肺組織濕/干比明顯增加，并促進了肺組織細胞凋亡，血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA分泌增加，SOD分泌降低，p53、Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下調(diào)，證明模型構(gòu)建成功。

重組人粒細胞刺激因子不僅可用于治療癌癥化療后粒細胞減少，還能用于造血干細胞移植、白血病治療等方面[10]。陸鵬和方小正[11]研究顯示，重組人粒細胞刺激因子能有效減輕肺損傷大鼠模型炎癥反應(yīng)，減緩炎性細胞浸潤，對肺損傷具有一定保護作用。宋靜和張?zhí)N萍[12]通過建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)重組人粒細胞刺激因子能促進急性肺損傷大鼠肺泡表面物質(zhì)再生，減緩炎癥反應(yīng)和肺組織細胞凋亡。本研究顯示，與模型組相比，治療組肺組織濕/干比、細胞凋亡率及血清TNF-α、IL-1β、IL-10、MDA明顯降低，SOD明顯升高，p53、Bax蛋白表達下調(diào)，Bcl-2蛋白表達上調(diào)，說明重組人粒細胞刺激因子治療急性肺損傷有一定效果。

骨髓間充質(zhì)干細胞能分泌多種生長因子，具有多向分化、造血、促進干細胞移植等功能，是組織功能的種子細胞[13]。骨髓間充質(zhì)干細胞移植能改善脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷大鼠血氣分析指標，抑制肺組織炎性因子分泌[14]。周航等[15]研究結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞能減緩肺損傷小鼠肺組織細胞凋亡，抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌。本研究結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞能降低急性肺損傷模型小鼠肺組織濕/干比、細胞凋亡率、MDA水平，抑制TNF-α、IL-1β、IL-10炎性因子分泌，并促進SOD活性，p53、Bax蛋白表達下調(diào)，Bcl-2蛋白表達上調(diào)，說明骨髓間充質(zhì)干細胞具有保護急性肺損傷的作用。重組人粒細胞刺激因子不僅能促進干細胞釋放，還能修復(fù)損傷組織[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)，與單一重組人粒細胞刺激因子和骨髓間充質(zhì)干細胞干預(yù)比較，聯(lián)合組能進一步降低模型小鼠肺組織濕/干比、細胞凋亡率、MDA，抑制TNF-α、IL-1β、IL-10分泌，增加SOD活性，下調(diào)p53、Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，說明二者聯(lián)合應(yīng)用效果優(yōu)于單一治療。

綜上，重組人粒細胞刺激因子和骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合治療急性肺損傷模型小鼠的效果優(yōu)于單一治療，能減少小鼠肺組織細胞凋亡，并減輕炎癥反應(yīng)和氧化反應(yīng)，對急性肺損傷具有保護作用。