欽越 陳志 楊章平

摘要：CRISPR/Cas9首次在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分，現(xiàn)已廣泛用于工程改造基因組中激活或抑制基因表達(dá)。同時(shí)，CRISPR/Cas9有望通過提供一種有效的技術(shù)來剖析癌癥發(fā)生的機(jī)制，確定藥物開發(fā)的靶標(biāo)，并可能為基于細(xì)胞的療法提供支撐以加速癌癥的研究。對CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展歷史和應(yīng)用范圍做了概述及展望，以期為CRISPR/Cas9技術(shù)的后續(xù)發(fā)展提供思路。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯;哺乳動(dòng)物

長期以來，基因療法一直被寄予希望可以治療或糾正人和動(dòng)物體內(nèi)的各種疾病和缺陷。隨著簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）的發(fā)現(xiàn)、基于CRISPR的原核生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（CRISPR相關(guān)系統(tǒng)，Cas）的機(jī)制以及它的再利用成為一種有效的基因編輯工具，使得分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化，并激發(fā)了人們對新的和改進(jìn)的基因治療的興趣。CRISPR/Cas9（規(guī)律性成簇間隔的短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白）系統(tǒng)是繼ZFN、TALENs等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù)，是現(xiàn)有基因編輯和基因修飾里面效率最高、最簡便、成本最低的技術(shù)之一，已成為當(dāng)今最主流的基因編輯系統(tǒng)。

一、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的起源

1987年，日本科學(xué)家在研究大腸桿菌的時(shí)候發(fā)現(xiàn)其基因組上有一段29bp的序列反復(fù)出現(xiàn)了數(shù)次且彼此之間被一段 32bp的序列所隔開。1993年，西班牙科學(xué)家Francisco Mojica在地中海噬鹽菌中也同樣發(fā)現(xiàn)了這段重復(fù)序列。隨著后續(xù)的研究，他在二十多種不同的微生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了這種重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)，并將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 （Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。通過對比多種細(xì)菌的幾千段CRIPSR序列，發(fā)現(xiàn)在 CRIPSR序列中存在許多片段與病毒的基因組序列高度一致，雖然不是完整的病毒基因組序列，但這些序列被夾在一段細(xì)菌精心設(shè)計(jì)的重復(fù)序列中。進(jìn)一步的研究證實(shí)，這些與病毒基因組高度一致的序列來自于噬菌體。2007年，CRISPR序列對于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的功能在嗜熱鏈球菌中得以證明。

2011年，美國化學(xué)家詹妮弗，杜德納與法國生物化學(xué)家埃馬紐埃爾，卡彭蒂耶合作開發(fā)CRISPR技術(shù)，并于一年后在《Science》雜志中首次指出，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外實(shí)驗(yàn)中能定點(diǎn)對DNA進(jìn)行切割，顯著提升了基因編輯的效率。2013年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授喬治。徹奇和華人科學(xué)家、麻省理工學(xué)院教授、博德研究所資深研究員張鋒分別相繼證明了CRISPR序列與Cas9蛋白結(jié)合可以在人類細(xì)胞中高效地定位、剪切和修改基因組。

二、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向?qū)NA（sgRNA）所組成，其中Cas9蛋白起切割DNA雙鏈的作用，sgRNA起向?qū)У淖饔茫趕gRNA的向?qū)峦ㄟ^堿基互補(bǔ)配對原則，Cas9蛋白可對不同的靶部位進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)DNA的雙鏈斷裂。

（一）CRISPR高度可變的間隔區(qū)的獲得

當(dāng)有外源DNA人侵細(xì)胞時(shí)，Cas1和Cas2編碼的蛋白會對該DNA進(jìn)行識別，并在過程中尋找到該DNA的PAM區(qū)域，CRISPR將以該P(yáng)AM區(qū)域附近的DNA序列作為候選的原型間隔序列。在識別后，Cas1/2蛋白復(fù)合物會對選擇出的間隔序列進(jìn)行剪切處理，同時(shí)，會有一部分酶將原間隔序列插人到CRISPR序列的前導(dǎo)區(qū)下游區(qū)域。在通常情況下，斷裂的DNA會采用高效的非同源末端連接方式（NHEJ）進(jìn)行自我修復(fù)，將被剪切的雙鏈缺口閉合。經(jīng)過該階段，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中。

（二）CRIPSR基因座的表達(dá)

CRISPR序列的前導(dǎo)區(qū)會調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pre-CRIS-PR RNA，tracrRNA（反式激活crRNA）在此時(shí)也會被轉(zhuǎn)錄出來與pre-crRNA序列進(jìn)行互補(bǔ)。pre-CRISPR RNA通過堿基互補(bǔ)配對與tracrRNA形成雙鏈RNA并與Cas9編碼的蛋白組裝成一個(gè)復(fù)合體。該復(fù)合體的目的是根據(jù)外源DNA的類型選取不同的間隔序列RNA，并在核糖核酸酶III（RNaseIII）的協(xié)助下進(jìn)行剪切，最終形成一段短小的CRISPR RNA（包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復(fù)序列區(qū)）。

（三）CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮

由CRISPR RNA，Cas9以及tracrRNA組成的復(fù)合物將識別整個(gè)外源DNA序列，并識別出與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列。這時(shí)，復(fù)合物將定位到PAM/原間隔序列的區(qū)域，DNA雙鏈將被解開，形成R一Loop。此時(shí)crRNA與互補(bǔ)鏈相連接，而另一條鏈則保持游離狀態(tài)。Cas9蛋白隨后會精準(zhǔn)的平端切割位點(diǎn)位于PAM上游3個(gè)核苷酸的位置，形成平末端產(chǎn)物。Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)配對的那一條DNA鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割另外一條非互補(bǔ)DNA鏈。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB），外源DNA的表達(dá)被沉默。

三、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

（一）基因敲除（Knock-out）

在通常情況下，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂的情況時(shí)，會采用高效的非同源末端鏈接（Non-homologous end join-ing，NHEJ）對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。但是，在修復(fù)過程中通常會發(fā)生堿基插人或缺失的錯(cuò)配現(xiàn)象，造成移碼突變，使靶標(biāo)基因失去功能。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以利用Cas9蛋白對靶基因組進(jìn)行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因敲除。

Zhou等川利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對山羊成纖維細(xì)胞中的BLG位點(diǎn)進(jìn)行敲除，獲得p-乳球蛋白（BLG）基因敲除山羊，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在敲除山羊的乳汁中BLG蛋白表達(dá)極顯著降低，為羊奶的品質(zhì)優(yōu)化提供了有效依據(jù)。G.N.Singina等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了PAEP和LOC100848610基因敲除的胚胎成纖維細(xì)胞系以用于生產(chǎn)不合成p-乳球蛋白的牛的轉(zhuǎn)基因后代。Watanabe等使用CRISPR / Cas9在人胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細(xì)胞系中敲除 KDM6A，證明KDM6A缺失的細(xì)胞表現(xiàn)出侵襲性表型。Yuza等4證實(shí)，敲除PAN02細(xì)胞中的SphK1基因可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。利用CRISPR /Cas9技術(shù)，Chugh等日將 C1CALT1基因從PDAC細(xì)胞中敲除，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長速度、遷移率等指標(biāo)的表達(dá)都有顯著提高。在胰腺癌的研究中，也有許多基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究，即敲除胰腺癌細(xì)胞的特異性基因，然后觀察不同表型的變化。

（二）基因敲入（Knock-in）

當(dāng)DNA雙鏈斷裂后，如果有DNA修復(fù)模板進(jìn)人到細(xì)胞中，基因組斷裂部分會依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），從而實(shí)現(xiàn)基因敲人。修復(fù)模板由需要導(dǎo)人的目標(biāo)基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）組成，同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復(fù)模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈，也可以是雙鏈DNA質(zhì)粒。HDR修復(fù)模式在細(xì)胞中發(fā)生率較低，通常小于10%。為了增加基因敲人的成功率，目前有很多科學(xué)家致力于提高HDR效率，將編輯的細(xì)胞同步至HDR最活躍的細(xì)胞分裂時(shí)期，促進(jìn)修復(fù)方式以HDR進(jìn)行;或者利用化學(xué)方法抑制基因進(jìn)行NHEJ，提高HDR的效率。魏姣舊等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在雞胚中注射腺病毒載體比慢病毒載體具有更高的轉(zhuǎn)染效率，通過CRISPR /Cas9腺病毒載體注射可以在雞胚ATP5E位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)EGFP基因敲人。Xie等利用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功地將豬RSAD2基因（pRSAD2）定點(diǎn)插人到豬rosa26（pR0-SA26）位點(diǎn)，獲得了pRSAD2基因敲人PK一15細(xì)胞（pRSAD2-KI）和豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFFs），并從 pRSAD2-KI豬分離的成纖維細(xì)胞減少了CSFV的感染。Chu等圖應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)將8-11kb插人片段敲人C57BL/6小鼠受精卵的Rosa26中，在此基礎(chǔ)上建立了Cre/loxP依賴性進(jìn)行Cas9表達(dá)的新小鼠系。

（三）基因抑制/激活（Repression or Activation）

Cas9具有獨(dú)立切割和結(jié)合靶基因的能力，其能夠通過點(diǎn)突變的方式使RuvC-和HNH一兩個(gè)Cas9的結(jié)構(gòu)域失活，形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)，從而抑制基因表達(dá);將dCas9結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會對基因組DNA造成永久性的改變。陳渙蘭等9通過基因抑制的方法構(gòu)建了1種雙質(zhì)粒CRISPR-dCas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以抑制乳酸乳球菌NZ9000基因轉(zhuǎn)錄，通過此方法成功將乳酸乳球菌NZ9000中假定的青霉素?；D(zhuǎn)移酶LLNZ-07335鑒定為膽鹽水解酶。Brook E. Heaton等叫使用CRISPR激活技術(shù)對限制IAV感染的基因進(jìn)行了全基因組過表達(dá)篩選，并通過鑒定篩選出了B4GALNT2基因，該基因雖然通常不在肺中表達(dá)但能夠完全預(yù)防IAV感染，該因子可在將來用于預(yù)防嚴(yán)重的人和禽流感疾病。

（四）基因多重編輯（Multiplex Editing）

將多個(gè)sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，可同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行編輯，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應(yīng)用包括：使用雙Cas9 nickases提高基因敲除的準(zhǔn)確率、大范圍的基因組缺失及同時(shí)編輯不同的基因。通常情況下，一個(gè)質(zhì)粒上可以構(gòu)建2～7個(gè)不同的sgRNA進(jìn)行多重CRISPR基因編輯。

（五）功能基因組篩選

利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞，因此，利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的?；蚪M篩選的傳統(tǒng)方法是shRNA技術(shù)，但是shRNA有其局限性：具有很高的脫靶效應(yīng)以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結(jié)果。CRISRP/Cas9系統(tǒng)的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優(yōu)勢，在基因組篩選中得到了廣泛的應(yīng)用。目前，CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因，如對化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫對潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等。

四、CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的問題及展望

CRISPR /Cas9系統(tǒng)與ZFN和TALEN的基于蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合的一個(gè)關(guān)鍵區(qū)別是使用短RNA序列作為特異性決定元件來驅(qū)動(dòng)靶部位DSB的形成。CRISPR/CAS9的使用避免了蛋白質(zhì)工程開發(fā)針對特定DNA靶序列的位點(diǎn)特異性核酸酶的需要，只需要合成一段新的RNA。這大大簡化并減少了基因編輯設(shè)計(jì)和實(shí)施所需的時(shí)間。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)近年來發(fā)展迅速，已取代之前的基因編輯技術(shù)，然而要充分實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的潛力，仍需要應(yīng)對許多挑戰(zhàn)。

目標(biāo)位點(diǎn)的選擇和sgRNA設(shè)計(jì)是一件非常復(fù)雜的工作。Cradick等叫在他們的研究中表明，CRISPR/Cas9的特異性可能低于ZFN或TALEN，這是因?yàn)槠浒邢蛐蛄邢鄬^短。因此，sgRNA的合理設(shè)計(jì)仍然需要大量的工作，目前并沒有簡單的算法可以幫助科研人員進(jìn)行設(shè)計(jì)。同時(shí)，為了提高特異性和減少脫靶率，Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)也并不簡單，同樣需要大量的工作。雖然Cas9本身不會引起脫靶效應(yīng)，但對Cas9蛋白的改進(jìn)可以限制這些效應(yīng)。

關(guān)于sgRNA和Cas9蛋白的遞送仍然是CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用的障礙之一，目前還沒有出現(xiàn)通用的遞送方法。雖然已經(jīng)出現(xiàn)許多可用于將CRISPR傳遞到單元的多種方法，但每種方法都有利有弊，有些方法可能非常特殊或不適合某些類型的傳遞。

活體生物的安全性也一直是一個(gè)令人擔(dān)憂的問題，能夠以高特異性靶向所需細(xì)胞的遞送工具也將限制非靶標(biāo)效應(yīng)并提高安全性。在納米顆粒載體的情況下，對組件的安全性進(jìn)行長期研究是至關(guān)重要的。目前，關(guān)于納米顆粒傳遞系統(tǒng)的各種成分最終在體內(nèi)的哪里，它們在那里停留了多長時(shí)間，以及是否有任何與任何成分相關(guān)的長期毒性的信息和研究仍是有限的。

CRISPR是現(xiàn)代基因工程的新面孔。2020年，詹妮弗.杜德納和埃馬紐埃爾，卡彭蒂耶被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，以表彰她們在“憑借開發(fā)基因組編輯方法”方面作出的貢獻(xiàn)，諾貝爾委員會在官方頒獎(jiǎng)詞中表示：“借助這些技術(shù)，研究人員可以非常精準(zhǔn)地改變動(dòng)物、植物、和微生物的DNA。CRISPR /Cas9基因剪刀徹底改變了分子生命科學(xué)，為植物育種帶來了新機(jī)遇，有望催生創(chuàng)新性癌癥療法，并可能使治愈遺傳性疾病這一人類夢想美夢成真?！蔽覀円蚕Ｍ鸆RIS-PR/Cas9最終能夠?qū)崿F(xiàn)這個(gè)愿望，當(dāng)然這是一個(gè)仍然需要繼續(xù)研究的重要領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhou W，Wan Y，Guo R，et al.Generation of Beta-lactoglobulin Knock- out Goats Using CRISPR/Cas9.PLoS One.2017 0ct 10;12（10）：e0186056.

[2]Singina GN，Sergiev PV，Lopukhov AV，et al.Production of a Cloned Off- spring and CRISPR/Cas9 Genome Editing of Embryonic Fibroblasts in Cattle. Dokl Biochem Biophys.2021 May;496（1）：48-51.

[3]Watanabe S，Shimada S，Akiyama Y，et al.Loss of KDM6A Characterizes a Poor Prognostic Subtype of Human Pancreatic Cancer and Potenti- ates HDAC Inhibitor Lethality.Int J Cancer. 2019 Jul 1;145（1）：192- 205

[4]Yuza K，Nakajima M，Nagahashi M，et al.Different Roles of Sphingosine Kinase I and 2 in Pancreatic Cancer Progression.J Surg Res.2018 Dec; 232：186-194.

[5]Chugh S，Barkeer S，Rachagani S，et al.Disruption of Clgaltl Gene Pro- motes Development and Metastasis of Pancreatic Adenocarcinomas in Mice.Gastroenterology.2018 Nov;155（5）：1608-1624.

【6】魏姣，梁晶晶，徐雨，等.利用CRISPR/Cas9腺病毒載體在雞胚中進(jìn)行基因敲入研究【J】.中國家禽，2021，43（01）：30-37.

[7]Xie ZJiao H，Xiao H，et al.Generation of pRSAD2 Gene Knock-in Pig via CRISPR/Cas9 Technology.Antiviral Res.2020 Feb;174：104696. [8]Chu VT，Weber T，Graf R，et al.Efficient Generation of Rosa26 knock-in mice Using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes.BMC Biotechnol.2016 Jan 16;16：4.

【9】陳渙蘭，宋馨，夏永軍，等.乳酸菌CRISPR/dCas9基因抑制系統(tǒng)的構(gòu)建【A】.中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會.第十五屆益生菌與健康國際研討會摘要集【C】.中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會：中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會，2020：2.

[10]Heaton BE，Kennedy EM，Dumm RE，et al.A cRISPR ActivationScreen Identifies a Pan-avian Influenza Virus Inhibitory Host Factor. Cell Rep.2017 Aug 15;20（7）：1503-1512.

[11]Cradick TJ，F(xiàn)ine EJ，Antico CJ，et al.CRISPR/Cas9 Systems Targeting p-globin and ccR5 Genes Have Substantial off-target Activity.Nu- cleic Acids Res.2013 Nov;41（20）：9584-92.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目“miR-140調(diào)控奶牛乳腺脂肪酸代謝的分子機(jī)制研究”，項(xiàng)目編號：31802035。

作者簡介：路欽越（1997-），男，內(nèi)蒙古包頭人，碩士，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。

（責(zé)任編輯馮會利）