閆 平，張 彥，鄭 松

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

光果蕕(CaryopteristanguticaMaxim.)是馬鞭草科蕕屬植物,主要分布于中國陜西、河南、甘肅、四川等地的干燥山坡或路邊，高0.5～2 m，常野生，是羌族民間藥用植物,具有解毒消腫、消食理氣、活血止痛以及殺蟲等功效[1],常用于治療皮膚濕疹、酒瘡、女性崩漏、白帶和月經(jīng)不調(diào)等疾病。研究發(fā)現(xiàn)蕕屬植物具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[2]，光果蕕提取物具有抗氧化活性，對DPPH自由基、O2-自由基均有良好清除的作用，但是文獻(xiàn)中光果蕕黃酮的提取還只是傳統(tǒng)的索氏提取，提取效率比較低[3]，因此優(yōu)化光果蕕黃酮的提取工藝，提高光果蕕黃酮得率是研究的關(guān)鍵一步，通過文獻(xiàn)查閱，目前微波輔助離子液體在天然產(chǎn)物的提取中表現(xiàn)出非常好的輔助優(yōu)勢[4]。

離子液體[5-6]是一種綠色溶劑，在室溫下呈液體，其分子作用力和強(qiáng)溶解能力有利于有效成分的溶解，具有穩(wěn)定性好、溶解度高、蒸氣壓低、應(yīng)用范圍廣、電學(xué)性質(zhì)優(yōu)異、安全性高、可重復(fù)利用、對微波有良好的吸收效果等優(yōu)點(diǎn)[7-10]；但離子液體黏度高，不易從所獲得的產(chǎn)物中分離，需要用有機(jī)溶劑或超臨界CO2進(jìn)行反萃，并且價(jià)格高昂、具有一定的生物毒性，在后期開發(fā)中存在困難。實(shí)驗(yàn)中選擇的離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽(C8H15N2Br)，分子量219.12，簡寫[BMZm]Br，其提取范圍較廣，對于黃酮類化合物具有不錯的提取效果[11]，但由于黏度較大，所以實(shí)驗(yàn)中將離子液體加入到體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中稀釋后再作為提取溶劑使用。

研究采用微波輔助離子液體的方法，結(jié)合響應(yīng)曲面法以及Design-Experts設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出光果蕕黃酮的最佳提取工藝，為后期研究光果蕕黃酮生物活性提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

光果蕕：采自太白山眉縣，經(jīng)生藥教研室汪興軍老師鑒定為馬鞭草科光果蕕；蘆丁：L9W6-8YWD，中國食品藥品檢定研究院。

1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽：純度≥97%，中科院蘭州化學(xué)物理研究所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇：分析純，市售。

微波超聲合成/萃取儀：XH-300A，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；紫外可見分光光度計(jì)：UV-762，上海佑科儀器儀表有限公司；電子天平：PTY-B5000，福州華志科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；數(shù)顯控溫電熱套：SXKW，北京市永光明醫(yī)療器械廠；鼓風(fēng)干燥箱：BOV101-70-Ⅱ，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：XD-52AA，上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；密封型搖擺式粉碎機(jī)：XL-16B，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 光果蕕黃酮樣品溶液的制備

取干燥的光果蕕粉碎過篩，t=40 ℃烘干至質(zhì)量恒定，索氏提取，t=80 ℃石油醚脫脂加熱回流至無色，取出藥材提取包，自然揮發(fā)干燥，得到樣品粉末。

精密稱取一定量的樣品粉末置于三頸燒瓶中，加入一定體積溶解有離子液體的φ(乙醇)=70%溶液，放入微波萃取器的化學(xué)反應(yīng)器中，設(shè)置一定的微波功率、提取溫度和反應(yīng)時(shí)間，提取完成后抽濾，抽濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中并定容，即得光果蕕黃酮樣品溶液。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，溶解并定容于100 mLφ(乙醇)=70%溶液中，充分搖勻振蕩，即得到ρ(蘆丁)=0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照不同質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行配置，參考文獻(xiàn)[12]在512 nm處測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=9.71x+0.055，R2=0.998 9。

1.2.3 光果蕕黃酮含量測定

精密吸取光果蕕黃酮樣品溶液1 mL，移至10 mL容量瓶中，φ(乙醇)=70%溶液定容，充分搖勻，再吸取1 mL，按照1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行測定，并根據(jù)已得到的線性回歸方程計(jì)算樣品溶液的光果蕕黃酮含量，計(jì)算光果蕕黃酮得率。

1.3 光果蕕黃酮單因素實(shí)驗(yàn)

用φ(乙醇)=70%溶液作溶劑，光果蕕黃酮得率為評價(jià)指標(biāo)，分別對微波功率、反應(yīng)時(shí)間、V(提取液)∶m(原料)(以下簡稱液料比)、V(乙醇)∶V(離子液體)(以下簡稱離子液體體積比)4個(gè)參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以確定各因素對光果蕕黃酮得率的影響以及良好的參數(shù)范圍。

1.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6.1 Trial中的Box-Behnken，以微波功率(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、粉末液料比(C)、離子液體體積比(D)4個(gè)因素為變量[13]，以光果蕕黃酮得率為響應(yīng)值，每個(gè)變量按高(+1)、中(0)、低(-1)3個(gè)水平進(jìn)行分析，見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素提取光果蕕黃酮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率對光果蕕黃酮得率的影響

精密稱取0.50 g光果蕕粉末于三頸燒瓶中，固定離子液體體積比為20、液料比為50 mL/g、反應(yīng)時(shí)間為6 min，考察微波功率對光果蕕黃酮得率的影響，見圖1。

微波功率/W圖1 微波功率對光果蕕黃酮得率的影響

由圖1可知，當(dāng)微波功率從150 W增至550 W，黃酮得率呈上升趨勢，可能的原因是物料吸收了微波能，內(nèi)部的分子劇烈運(yùn)動使細(xì)胞破裂，黃酮溶出增加，得率增高[14]；當(dāng)功率從550 W繼續(xù)增至950 W，得率呈下降趨勢，可能的原因是隨著微波功率增加，溫度上升過快,導(dǎo)致黃酮穩(wěn)定性降低。因此，在后續(xù)的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)中采用350、550、750 W的微波功率梯度。

2.1.2 微波反應(yīng)時(shí)間對光果蕕黃酮得率的影響

精密稱取0.50 g光果蕕粉末于三頸燒瓶中，固定離子液體體積比為50、液料比為20 mL/g、微波功率為550 W，考察反應(yīng)時(shí)間對光果蕕黃酮得率的影響，見圖2。

t/min圖2 反應(yīng)時(shí)間對光果蕕黃酮得率的影響

由圖2可知，t=4～8 min，黃酮得率升高，可能的原因是物料中的黃酮隨反應(yīng)時(shí)間的增加不斷溶出，使得率增高；t=8～20 min，得率持續(xù)下降，但下降趨勢較緩。其一可能是反應(yīng)時(shí)間過長，長時(shí)間受熱導(dǎo)致所溶出的黃酮被破壞，提取液中的黃酮含量減少，得率降低；其二可能是反應(yīng)時(shí)間過長導(dǎo)致溶液中的雜質(zhì)溶出增多，黃酮溶出減少，得率降低。因此，在后續(xù)的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)中采用4、8、12 min的反應(yīng)時(shí)間梯度。

2.1.3 粉末液料比對光果蕕黃酮得率的影響

精密稱取0.50 g光果蕕粉末于三頸燒瓶中，固定離子液體體積比為50、反應(yīng)時(shí)間為8 min、微波功率為550 W，考察液料比對光果蕕黃酮得率的影響，見圖3。

液料比/(mL·g-1)圖3 粉末液料比對光果蕕黃酮得率的影響

由圖3可知，液料比為10～20 mL/g時(shí)，黃酮快速從植物細(xì)胞中溶解出來導(dǎo)致得率直線上升，液料比達(dá)到20 mL/g時(shí)，得率最高；當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)，過多的溶劑使微波能傳遞能力逐步減弱，細(xì)胞破裂不完全，黃酮不能充分溶解，導(dǎo)致得率不斷下降。因此，在后續(xù)的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)中采用10、20、30 mL/g的液料比梯度。

2.1.4 離子液體體積比對光果蕕黃酮得率的影響

精密稱取0.50 g光果蕕粉末于三頸燒瓶中，固定液料比為20 mL/g、反應(yīng)時(shí)間為8 min、微波功率為550 W，考察離子液體體積比對光果蕕黃酮得率的影響，見圖4。

離子液體體積比圖4 離子液體體積比對光果蕕黃酮得率的影響

由圖4可知，當(dāng)離子液體體積比從10增至40，黃酮得率不斷提高，可能的原因是比值大時(shí)溶劑黏稠度變低，擴(kuò)散能力增強(qiáng)，利于黃酮的溶出[15]；當(dāng)比值從40增大至50，得率下降，但幅度較小，可能的原因是此時(shí)離子液體濃度較低，不利于萃取。因此，后續(xù)的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)中采用30、40、50的離子液體體積比梯度。

2.2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表

以光果蕕黃酮得率(Y)為響應(yīng)值，對表1進(jìn)行四因素三水平評價(jià)，得率結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表

對上述方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，黃酮得率回歸模型結(jié)果見表3。

表3 顯著性檢驗(yàn)和方差分析表1)

2.2.2 響應(yīng)面分析

單因素兩兩之間交互作用的響應(yīng)曲面圖見圖5～圖10。

圖5 微波功率與反應(yīng)時(shí)間的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖5可知，A、B交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為23.58 mg/g，此時(shí)微波功率為750 W，反應(yīng)時(shí)間為12 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

圖6 微波功率與液料比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖6可知，A、C交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為25.74 mg/g，此時(shí)微波功率為750 W，反應(yīng)時(shí)間為8 min，液料比為30 mL/g，離子液體體積比為40。

圖7 微波功率與離子液體體積比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖7可知，A、D交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為18.30 mg/g，此時(shí)微波功率為550 W，反應(yīng)時(shí)間為8 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

圖8 反應(yīng)時(shí)間與液料比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖8可知，B、C交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為18.30 mg/g，此時(shí)微波功率為550 W，反應(yīng)時(shí)間為8 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

圖9 反應(yīng)時(shí)間與離子液體體積比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖9可知，B、D交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為18.30 mg/g，此時(shí)微波功率為550 W，反應(yīng)時(shí)間為8 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

圖10 液料比與離子液體體積比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖10可知，C、D交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為18.30 mg/g，此時(shí)微波功率為550 W，反應(yīng)時(shí)間為8 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

通過Design-Exoert 8.0.6 Trial分析得到最佳提取工藝為微波功率750 W，反應(yīng)時(shí)間10.77 min，液料比20.27 mL/g，離子液體體積比37.77，此時(shí)的光果蕕黃酮得率預(yù)測值為22.99 mg/g。

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)的提取條件下進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證通過響應(yīng)曲面建立模型的可靠性，綜合考慮實(shí)操性，實(shí)際提取條件為微波功率750 W，反應(yīng)時(shí)間11 min，液料比20 mL/g，離子液體體積比38，平行3次實(shí)驗(yàn)，測得光果蕕w(黃酮)=24.83、24.97、25.22 mg/g，平均w(黃酮)=25.01 mg/g，接近預(yù)測值，說明響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定可行。

2.4 微波輔助離子液體提取光果蕕不同部位w(黃酮)

在2.3中驗(yàn)證了優(yōu)化后的提取條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該條件具有一定的可行性，在該條件下對光果蕕莖、葉、花中的黃酮平行3次提取，結(jié)果見表4。

表4 光果蕕不同部位w(黃酮) mg/g

由表4可知，光果蕕莖、葉、花3個(gè)部位中都含有一定量的黃酮，葉中最高，花中次之，莖中最少。

3 結(jié) 論

采用單因素分析結(jié)合響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)的方法，研究了微波輔助離子液體提取光果蕕中黃酮的影響因素和工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對光果蕕黃酮得率的影響大小關(guān)系依次為微波功率>反應(yīng)時(shí)間>離子液體體積比>液料比，且微波功率影響最大。利用Design-Exoert優(yōu)化出最佳提取工藝為微波功率750W，反應(yīng)時(shí)間11 min，液料比20 mL/g，離子液體體積比38，在該提取工藝條件下的光果蕕黃酮平均含量為25.01 mg/g。在微波輔助離子液體的雙重作用下，提取光果蕕黃酮具有反應(yīng)時(shí)間短、提取效率高、消耗溶劑較少、實(shí)驗(yàn)操作簡單、無污染等優(yōu)點(diǎn)。

微波輔助提取技術(shù)具有高效、高得率、短提取時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)[16-17]，微波結(jié)合離子液體相輔相成，極大提高黃酮得率，縮短反應(yīng)時(shí)間，且儀器操作簡單，節(jié)省資源，綠色環(huán)保，可以為日后的工業(yè)發(fā)展作參考。