吳 雙，邢金云，王 燕，田 薇，任秀梅

（南通大學附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001）

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關節(jié)疼痛為主要表現(xiàn)，伴有局部腫脹、畸形、功能活動受限的慢性關節(jié)疾病。隨著人口老齡化不斷加劇，膝骨關節(jié)炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。流行病學顯示，我國65歲以上的人群中本病的發(fā)病率高達85%[1]，嚴重影響了中老年人生活質量。目前國內外治療KOA的方法眾多，以非甾體抗炎藥為代表的藥物治療及手術治療較為常見，但因其副作用大、費用昂貴，臨床應用具有一定的局限性。艾灸作為中醫(yī)傳統(tǒng)治療方法，借助燒灼艾葉產(chǎn)生的溫熱效應和藥理作用，安全有效，無毒副作用，可達到防病治病的目的，對膝骨關節(jié)炎的防治具有獨特優(yōu)勢。本研究通過觀察艾灸“犢鼻”“足三里”對KOA模型兔的膝關節(jié)軟骨病理學及行為學的影響，以期為臨床艾灸治療膝骨關節(jié)炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康新西蘭大耳白兔40只，雌雄不限，6個月齡，體質量2.0~3.0 kg，由南通大學動物實驗中心提供，動物合格證號：201829201。所有動物飼養(yǎng)于南通大學動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境保持在溫度23℃，濕度50%，單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，自由攝水。實驗過程嚴格遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 藥物與試劑艾灸條（泰州市灸療技術研究所泰州久火灸療用品有限公司，產(chǎn)品標準號：Q/321203CJL002-2016）；1、5 mL一次性使用無菌注射器（上海康德萊企業(yè)發(fā)展集團股份有限公司，醫(yī)療器械注冊證編號：國械標準20163150518）；75%酒精溶液（山東安捷高科消毒科技有限公司，標準號：Q/371402AAJ008），以上均由南通大學附屬醫(yī)院針灸科提供。木瓜蛋白酶（美國Worthington，活力：200萬單位/g）；p38阻斷劑SB203580（APEXBIO，Houston，USA；貨 號：A8254）；蘇 木素、伊紅染料（PHYGENE，貨號：PH0516）。

1.3 主要儀器手術刀片（華佗牌，生產(chǎn)編號：20010020）；RM2135型石蠟切片機（德國徠卡）；Leica DM4000B型顯微鏡（德國徠卡）；DW-86L628型-70℃低溫冰箱（中國海爾）。

1.4 造模與分組將40只新西蘭大耳白兔根據(jù)體質量由Excel 2003產(chǎn)生隨機數(shù)字表，隨機分為對照組、模型組、艾灸組、抑制劑組，每組10只。所有兔于相同條件下適應性喂養(yǎng)1周，記錄各組兔體質量，觀察精神狀態(tài)、活潑程度、進食量等情況無差別后，在無菌條件下，對模型組、艾灸組、抑制劑組兔采用注射木瓜蛋白酶法造模[2-4]。具體操作：將4 g木瓜蛋白酶用100 mL的生理鹽水配成4%的濃度，將實驗兔固定于固定器中，屈曲右后肢膝關節(jié)，局部碘伏棉簽消毒后，自髕韌帶外側進針，將提前配置好的4%木瓜蛋白酶溶液按照0.1 mL/kg注射于右膝關節(jié)腔內。造模結束后繼續(xù)歸籠喂養(yǎng)，每日驅趕兔活動30 min，2周后對比觀察發(fā)現(xiàn)模型組、抑制劑組、艾灸組兔右后肢膝關節(jié)出現(xiàn)腫脹、屈伸功能障礙，并評估Lequesne評分，總分＞4分為造模成功。

1.5 實驗干預艾灸組：參照《實驗針灸學》家兔針灸穴位圖及人犢鼻穴、足三里穴，將兔置于固定器中，四肢束縛制動，右后肢簡單剃毛后，作穴位定位，艾條點燃施灸于右后肢犢鼻穴、足三里，艾條燃端距離穴位處皮膚2 cm。施灸過程中觀察兔的反應，每穴每次15 min，5次/周，連續(xù)治療3周。抑制劑組：制作KOA模型后立即關節(jié)腔內注射p38阻斷劑SB203580 0.1 mL（100 μmol/L），1次/周，連續(xù)治療3周。模型組：制作KOA模型后，不予治療，單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食；參照艾灸組與抑制劑組每日固定器固定30 min。對照組：不造模，不治療，單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食；參照艾灸組與抑制劑組每日固定器固定30 min。

1.6 觀察指標

1.6.1 Lequesne評分 治療前及每周治療結束后均由同一名不參與實驗的課題組成員稱質量并評估Lequesne評分，測定其膝關節(jié)狀態(tài)改變與行為學改變。評估內容包括局部疼痛刺激反應、步態(tài)改變、關節(jié)活動范圍、關節(jié)腫脹程度4個方面，由同一名不知情的非本實驗人員進行評分并記錄總分。評分標準見表1。

表1 Lequesne評分標準

治療前Lequesne評分：造模結束2周后，艾灸、抑制劑干預治療前即對全部兔進行評分，觀察其右后肢膝關節(jié)腫脹情況，對局部按壓的疼痛反應程度及關節(jié)可自由活動的角度，驅趕兔并觀察步態(tài)情況，評分并記錄總分；治療后Lequesne評分：艾灸、抑制劑干預治療后次日，由同一觀察者重復上述操作。

1.6.2 關節(jié)軟骨觀察 治療3周后，耳緣靜脈注射空氣處死各組兔，置于手術臺上，使其呈仰臥位，先后伸直并固定其雙側膝關節(jié)，使用手術刀將右膝髕骨處皮膚、肌肉、韌帶依次切開剝離后，肉眼觀察右膝關節(jié)腔內關節(jié)軟骨表面整體情況，拍照并記錄其顏色、質地、光滑程度。使用尖刀片切取右膝膝關節(jié)表面正中軟骨約100 mg軟骨標本，用生理鹽水洗凈后，直接置于體積分數(shù)4%的中性甲醛中，固定72 h；將膝股骨遠端及脛骨近端連同軟骨下骨一并鋸下，去除周圍軟組織，將切除的完整組織標本立即放入4%多聚甲醛液中，固定48 h，置于脫鈣液（甲醛10 mL，硝酸20 mL，雙蒸水90 mL）中脫鈣24 h，并常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，沿膝關節(jié)矢狀面切片，脫蠟、透明后行HE染色，顯微鏡下進行組織學觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法使用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用“均數(shù)±標準差”（±s）表示，計量資料均進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，3組模型兔治療前后得分比較采用重復測量方差分析；組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組兔Lequesne評分比較造模后，模型組、抑制劑組、艾灸組兔Lequesne評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.916＞0.05），具有可比性。

組間比較：治療1周、2周、3周后，艾灸組、抑制劑組Lequesne評分均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；艾灸組與抑制劑組兔Lequesne評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

組內比較：艾灸組、抑制劑組兔治療1周、2周、3周后Lequesne評分均明顯低于治療前（P＜0.01），模型組兔僅于治療第3周后Lequesne評分低于治療前（P＜0.01）。（見表2）

表2 各組兔治療前后Lequesne評分比較（±s，分）

表2 各組兔治療前后Lequesne評分比較（±s，分）

注：F時間主效應=330.880，P時間主效應=0.000；F分組主效應=29.096，P分組主效應=0.000；F交互效應=17.183，P交互效應=0.001；與模型組比較，aP＜0.01；與同組治療前比較，bP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 治療前 治療1周后 治療2周后 治療3周后 F P模型組 10 8.80±0.327 8.40±0.221 7.70±0.271 6.25±0.261b 40.085 0.000抑制劑組10 8.70±0.367 6.45±0.273ab 5.45±0.283ab 3.70±0.186ab 285.000 0.000艾灸組 10 8.90±0.458 6.50±0.298ab 4.85±0.150ab 3.30±0.170ab 116.157 0.000 F 0.088 21.632 43.460 99.845 P 0.916 0.000 0.000 0.000

干預方式與時間存在交互作用，變化趨勢相同，治療后Lequesne評分較治療前均降低，其中艾灸組與抑制劑組下降趨勢較模型組更明顯。（見圖1）

圖1 交互效應輪廓圖

2.2 各組兔膝關節(jié)軟骨觀察對照組兔關節(jié)解剖后肉眼可見關節(jié)局部境界清晰，無腫脹，關節(jié)周圍肌肉飽滿無萎縮，關節(jié)間隙未見狹窄，軟骨表面光滑，無積液；模型組兔關節(jié)解剖后肉眼可見關節(jié)局部明顯腫脹，關節(jié)周圍肌肉明顯萎縮，關節(jié)間隙狹窄，軟骨表面粗糙，關節(jié)囊肥大增厚，有淡黃色渾濁黏稠分泌物；艾灸組與抑制劑組差距較小，均可見關節(jié)局部較對照組輕微腫脹，腫脹程度均明顯輕于模型組，關節(jié)周圍肌肉萎縮不明顯，關節(jié)囊輕度增生，關節(jié)間隙稍變窄，軟骨表面尚平滑，少量乳白色分泌物。（見圖2）

圖2 各組兔膝關節(jié)軟骨比較

2.3 各組兔膝關節(jié)軟骨病理學改變對照組切片中髓腔內細胞分布均勻，細胞數(shù)量正常；模型組切片中髓腔內可見明顯細胞聚集，分布雜亂，大量炎細胞浸潤，炎細胞數(shù)量明顯增多；艾灸組及抑制劑組切片中髓腔內炎細胞聚集程度及數(shù)量較模型組明顯減少。（見圖3）

圖3 各組兔膝關節(jié)軟骨病理學改變（HE，×200）

3 討 論

膝骨關節(jié)炎（KOA）是以關節(jié)軟骨的退行性改變和繼發(fā)性骨質增生為特征的疾病，其病理改變以軟骨變性、關節(jié)增生、骨贅形成為主。隨著人年齡的增長，關節(jié)軟骨變性破壞，加上關節(jié)活動過多，關節(jié)增生骨贅形成，刺激周圍軟組織，導致炎癥性充血滲出、炎性滲出物壓迫，引起不同程度的疼痛、腫脹及關節(jié)活動障礙。因此，抑制炎癥反應、緩解疼痛、改善膝關節(jié)功能活動，對膝骨關節(jié)炎的治療具有重要意義[5]。近年來，對于膝骨關節(jié)炎的臨床研究大多從炎癥反應機制、軟骨代謝機制、血液循環(huán)機制[6]等方面展開。本研究以艾灸抑制膝關節(jié)局部炎癥反應，改善膝關節(jié)局部血液微循環(huán)，減輕膝關節(jié)局部疼痛為切入點，觀察艾灸“犢鼻”“足三里”對KOA模型兔膝關節(jié)軟骨病理學及行為學的影響。

p38 MAPK信號通路是MAPKs通路中的重要分支，在疼痛信息傳遞過程中起到重要作用，與細胞炎癥、應激、凋亡的調控密切相關[7]。當p38 MAPK受到炎性因子等外界刺激被激活后發(fā)生磷酸化，使機體的痛閾降低，疼痛敏感[8]。而此過程能被p38 MAPK的阻斷劑SB203580阻斷，特異性的與兩種序列非常相近的蛋白質結合并抑制其活性，從而有效地抑制炎癥因子。YANG K Y等[9]研究發(fā)現(xiàn)注射p38 MAPK抑制劑SB203580能有效緩解痛覺過敏。因此，對于p38 MAPK信號通路的調控與膝骨關節(jié)炎病程的發(fā)展密切相關。

中醫(yī)學認為，KOA屬“痹證”范疇?！肮使潜圆灰?，復感于邪，內會于腎；筋痹不已，復感于邪，內會于肝”?！端貑枴ど瞎盘煺嬲撈分杏涊d：“丈夫八歲，腎氣實……七八，肝氣衰，筋不能動”。膝骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展主要是由于年老體弱，筋骨失養(yǎng)，肝腎虧虛，氣血不足，復感外邪，風寒濕熱侵襲肢體，經(jīng)絡痹阻，日久氣血瘀滯，筋脈拘攣，屈伸不利，不通則痛，發(fā)為本病[10]。本病以虛為主，虛中夾實。因此，中醫(yī)治療應以培本固元，補氣活血為主。

由于西藥、手術方法臨床治療KOA的局限性，中醫(yī)藥治療KOA的研究越來越多。艾灸療法作為中國傳統(tǒng)的治療方法，追古溯今，源遠流長?！端貑枴ぎ惙ǚ揭苏撈分杏涊d：“臟寒生滿病，其治宜灸焫”[11]。艾灸療法將艾葉等材料加工制成艾條，燃燒后在體表特定穴位上方溫熨，借助灸火的熱力和艾葉的藥理作用，激發(fā)經(jīng)絡氣血的運行，起到溫經(jīng)散寒、活血化瘀、通絡止痛、扶正祛邪的作用，從而達到防治疾病的目的。相關研究表明[12]，燃燒艾灸產(chǎn)生的熱量通過腧穴傳入體內，達到疏經(jīng)通絡止痛的作用，從而改善關節(jié)活動功能障礙。本課題組前期研究顯示[13-14]，艾灸可明顯改善膝骨關節(jié)炎患者疼痛、僵硬、功能障礙等臨床表現(xiàn)，并能改善患者的生存質量，是一種安全、有效的治療方法。

本研究選取“犢鼻”“足三里”，從腧穴角度看，兩穴均歸多氣多血之足陽明胃經(jīng)，犢鼻穴位于髕骨外側下方，髕韌帶外側凹陷中，具有祛風散寒、通利關節(jié)的作用；足三里穴位于犢鼻穴下3寸，距脛骨前嵴約一橫指，具有活血通經(jīng)、扶正培元的作用。從解剖角度看，兩穴均位于膝周，膝關節(jié)局部皮膚薄而松弛，皮下脂肪少，周圍有韌帶加強關節(jié)的穩(wěn)定，股動脈、腘動脈、脛前動脈等多個分支在其周圍吻合形成動脈網(wǎng)，具有豐富的血供。許多研究證實艾灸的溫通作用能夠降低血液黏稠度和血小板的聚集，增加缺血組織血流量，有效改善血液微循環(huán)，促進膝關節(jié)動脈網(wǎng)功能的恢復，刺激局部肌肉，維持膝關節(jié)結構穩(wěn)定，還可降低關節(jié)滑膜炎癥，減輕關節(jié)軟骨的破壞。李秀彬等[15]通過觀察隔附子餅灸對膝骨關節(jié)炎患者血液流變學指標的影響，發(fā)現(xiàn)艾灸能夠改善血液循環(huán)，清除自由基，減少炎癥刺激。

本實驗運用木瓜蛋白酶誘導法建立兔膝骨關節(jié)炎模型，結果顯示造模后，模型組可見明顯細胞聚集，且分布雜亂，大量炎細胞浸潤，炎細胞數(shù)量明顯較多；與模型組比較，艾灸組、抑制劑組炎癥細胞聚集現(xiàn)象明顯減輕，艾灸組與抑制劑組比較，炎癥細胞聚集現(xiàn)象差異不大；通過比較每周治療后Lequesne評分，我們發(fā)現(xiàn)艾灸組、抑制劑組較模型組Lequesne評分明顯降低，提示艾灸治療與抑制劑治療均能減輕膝關節(jié)炎局部腫脹、疼痛，改善關節(jié)活動度，這與課題組前期的臨床試驗結果相吻合[13]；雖然艾灸組與抑制劑組治療后Lequesne評分比較，差異無統(tǒng)計學意義，但是經(jīng)過3周的治療后，艾灸組Lequesne評分差值較抑制劑組更大。我們推測隨著治療時間的延長，艾灸療效逐步累積，兩組的差異會顯現(xiàn)出來，這有待于今后進一步的實驗研究。

結合組間膝關節(jié)軟骨病理學的改變與行為學改變可知，艾灸治療對膝骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨有保護作用，能夠有效地降低KOA兔膝關節(jié)炎癥聚集，減輕膝關節(jié)局部腫脹、疼痛，改善其活動步態(tài)與關節(jié)活動度，療效與p38 MAPK抑制劑SB203580治療相當。提示p38 MAPK信號通路可能參與了艾灸治療膝骨關節(jié)炎的過程。具體的分子機制有待于進一步的實驗研究。