黃 文，余可楠，廖婉雯，鐘瑞敏，曹 庸，苗建銀,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；2.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005）

我國是全球最大羅非魚養(yǎng)殖加工國[1]，約占同年全球總產(chǎn)量的13%，此中大部分羅非魚被用于魚片加工。羅非魚加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物占所用魚體總質(zhì)量的54%，其中魚頭、魚鱗占43%。然而我國目前對(duì)加工副產(chǎn)物合理利用率較低，不但造成了生物資源浪費(fèi)，也為環(huán)境增加負(fù)擔(dān)。因此，開發(fā)利用羅非魚副產(chǎn)物具有豐富的原料基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

鈣是人體的常量元素，占人體體重的1.5%～2%[2]，在人體代謝活動(dòng)中起著重要的作用，如提高細(xì)胞內(nèi)的代謝水平、促進(jìn)骨骼生長、維持心臟功能的穩(wěn)定等[3]。研究表明鈣攝入不足，會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)疏松癥、佝僂病[4]、結(jié)腸癌[5]、高血壓[6]等。我國成年居民鈣攝入不足的比例超過95%[7]，且由于植物源食材在人類飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)很大比例，其所含草酸、植酸等成分在人體小腸弱堿性環(huán)境下易與鈣元素形成不溶性鈣鹽，阻礙機(jī)體鈣吸收，并可能引發(fā)結(jié)石等病變[8]。目前針對(duì)缺鈣的治療以藥物治療為主，如雌激素、雷洛昔芬、氟化物等[9?11]，但大多數(shù)藥物具有較強(qiáng)的副作用，如長期進(jìn)行雌激素替代治療可能會(huì)導(dǎo)致乳腺癌[12?14]、血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)性増加，氟化物可導(dǎo)致腹痛、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀[15]。因此，針對(duì)缺鈣可能誘發(fā)的疾病和健康風(fēng)險(xiǎn)，迫切需要研究開發(fā)能安全有效提升鈣生物利用率的天然生物活性物質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶解物具有良好的結(jié)合鈣和促鈣吸收活性。目前有研究在南極鱗蝦[16]、鱈魚皮[17]，酪蛋白[18]、豬骨跟牛骨[19?20]等酶解物中獲得鈣結(jié)合肽，并有效提高鈣的生物利用率。但以羅非魚鱗獲得鈣結(jié)合活性肽并對(duì)其鈣螯合特性進(jìn)行系統(tǒng)表征的研究鮮見報(bào)道。本文利用響應(yīng)面法對(duì)羅非魚鱗的膠原蛋白的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而得到鈣結(jié)合肽。采用氨基酸分析儀、紫外吸收光譜和紅外吸收光譜對(duì)羅非魚鱗鈣結(jié)合肽的特性進(jìn)行了分析。為后續(xù)羅非魚鱗鈣結(jié)合肽的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚鱗 廣東茂名新洲海產(chǎn)有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為2×105U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；無水氯化鈣、8-羥基喹啉和乙醇胺 天津宏達(dá)化學(xué)試劑廠；鄰甲酚酞絡(luò)合劑 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；其余試劑 均為分析純。

PHS-3CW pH 計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（京）有限公司；DF-101S 數(shù)顯恒溫水浴鍋 鞏義予華儀器有限公司；L530 臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；FD-1 型冷凍干燥機(jī) 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；S-433D 氨基酸分析儀 日本日立公司；UV-240IPC 型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Vertex70 傅立葉變換紅外光譜儀 布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚鱗預(yù)處理 羅非魚鱗脫脂脫鈣處理[21]，具體操作如下：羅非魚鱗用自來水將雜質(zhì)洗干凈，放入0.1 mol/L NaOH 溶液（w/v 1:10）攪拌24 h，清洗至中性；放入10% EDTA-2Na（pH 7.2，w/v 1:10）中，并置于4 ℃冷庫中，期間進(jìn)行攪拌處理5 d，隨后將魚鱗清洗至中性后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的鹽酸處理18 h后水洗至中性，即得到脫鈣羅非魚鱗。將水洗至中性的魚鱗中水分滴干，隨后置于55 ℃烘箱中烘干，取出置于密封袋中備用。

1.2.2 羅非魚鱗酶解工藝 羅非魚鱗按底物濃度加入蒸餾水→加入木瓜蛋白酶→調(diào)節(jié)pH 和溫度→恒溫酶解→滅酶→冷卻→離心→取上清

稱取羅非魚鱗于50 mL 離心管，按一定量的底物濃度加入蒸餾水，按一定的加酶量加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)一定的pH，設(shè)定一定的溫度后在水浴鍋中振蕩酶解一定的時(shí)間。所得酶解物經(jīng)90 ℃加熱10 min滅酶，冷卻至室溫，隨后4000 r/min 離心20 min，取上清液即得羅非魚鱗酶解物。

1.2.3 羅非魚鱗鈣結(jié)合肽酶解工藝單因素實(shí)驗(yàn) 酶解的單因素實(shí)驗(yàn)采用改變其中一個(gè)因素，保持其他因素不變方式，探究底物濃度、酶底比、pH、溫度和時(shí)間對(duì)羅非魚鱗鈣螯合活性的影響。單因素基礎(chǔ)條件設(shè)為：底物濃度6%，酶底比0.3%，pH7，酶解溫度55 ℃和酶解時(shí)間3 h。各個(gè)因素的水平梯度為，底物濃度：4%、6%、8%、10%；酶底比：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%；pH：5.5、6、6.5、7、7.5；酶解溫度：45、50、55、60、65 ℃；酶解時(shí)間：2、3、4、5 h。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 以底物濃度及酶解時(shí)間和酶底比為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor and level of response surface experiment

1.2.5 鈣螯合活性測定 鈣螯合活性的測定采用的是鄰甲酚酞比色法[21?22]。

1.2.5.1 鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別取標(biāo)準(zhǔn)鈣工作液（50 μg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于2 mL離心管中，分別加一級(jí)水1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL 混勻，在96 孔板上每孔30 μL，再加工作顯色液150 μL，搖勻，于570 nm 處內(nèi)比色，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 酶解液鈣螯合活性測定 取1 mL 的酶解上清液，1 mL 5 mmol/L CaCl2及2 mL 的磷酸鹽緩沖液（pH7.8）于10 mL 的離心管中，在37 ℃水浴反應(yīng)1 h，在4000 r/min 離心20 min。取上清液30 μL于96 孔板，在加入150 μL 的鄰甲酚酞工作液反應(yīng)后，在570 nm 測波長。鈣螯合活性計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：

鈣螯合活性（μg/mL）則為：

1.2.6 羅非魚鱗肽鈣螯合物的制備 將凍干的最優(yōu)條件下獲得的酶解物，加入蒸餾水，配置成5 mg/mL的溶液，按肽鈣比1:1 加入無水氯化鈣，在pH8，42 ℃下螯合47 min，加入反應(yīng)體系5 倍體積的無水乙醇后，4000 r/min 離心20 min，棄上清，取沉淀，冷凍干燥，獲得羅非魚鱗肽鈣螯合物。

1.2.7 氨基酸含量測定 樣品氨基酸含量測定參照GB5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》方法。

1.2.8 紫外吸收光譜測定 以蒸餾水為空白對(duì)照，將羅非魚鱗鈣結(jié)合肽和肽鈣螯合物分別配制1.0 mg/mL的水溶液，在200～400 nm 下進(jìn)行紫外掃描。

1.2.9 紅外吸收光譜測定 分別稱取2 mg 羅非魚鱗鈣結(jié)合肽、肽鈣螯合物樣品放入瑪瑙研缽中，加入200 mg 干燥光譜純KBr，混合研磨均勻，裝入模具加壓得透明樣品壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4000 cm?1區(qū)間掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）。用最小二乘法比較三組實(shí)驗(yàn)均值在（P<0.05）水平上是否存在顯著性差異。Origin 8.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚鱗鈣結(jié)合肽酶解制備

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 底物濃度對(duì)鈣螯合活性的影響 如圖1 所示，底物濃度在4%～6%，鈣螯合活性逐漸上升，在6%～8%，鈣螯合活性開始下降，在底物濃度為6%時(shí)，鈣螯合活性最高，達(dá)到（28±0.5）μg/mL。這是因?yàn)殡S著底物濃度的增加，酶與底物的接觸增加。當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，會(huì)達(dá)到水解峰值[23]。當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)，會(huì)抑制分子的擴(kuò)散和碰撞，從而降低了酶解的效率，鈣螯合活性降低。因此，選取底物濃度為4%、6%和8%進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化。

圖1 底物濃度對(duì)鈣螯合活性影響Fig.1 Effect of the concentration of substance on calcium chelation activity

2.1.1.2 酶底比對(duì)鈣螯合活性的影響 如圖2 所示，隨著酶對(duì)底物的作用增加，羅非魚鱗的鈣螯合活性增加，當(dāng)酶底比為0.3%時(shí)，鈣螯合活性最大。酶底比在0.3%以下，魚鱗蛋白的濃度一定時(shí)，酶解反應(yīng)并未達(dá)到飽和狀態(tài)，故鈣螯合活性小。隨著酶底比的增加，底物與酶飽和，酶水解效率不再與酶底比成正比，甚至呈下降趨勢[24]。因此選取酶底比為0.2%、0.3%和0.4%進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化。

圖2 酶底比對(duì)鈣螯合活性影響Fig.2 Effect of enzyme to substrate ratio on calcium chelation activity

2.1.1.3 pH 對(duì)鈣螯合活性的影響 如圖3 所示，當(dāng)pH 在5.5～7.5 之間時(shí)，隨著pH 的增加，鈣螯合活性先緩慢增加后下降，pH 為7 時(shí)，鈣螯合活性最大值為（28.63±0.3）μg/mL。當(dāng)pH 在7～7.5 之間時(shí)，螯合鈣活性降低。pH 可以通過影響酶的活性基團(tuán)和空間結(jié)構(gòu)影響酶解的效果[25]。當(dāng)pH 高于或低于最佳pH 時(shí)，酶的活性中心構(gòu)象發(fā)生變化，破壞其空間結(jié)構(gòu)，從而抑制酶活性，鈣螯合活性也因此下降[26]。

圖3 pH 對(duì)鈣螯合活性影響Fig.3 Effect of pH on calcium chelation activity

2.1.1.4 酶解溫度對(duì)鈣螯合活性的影響 如圖4 所示，隨著酶解溫度的升高，鈣螯合的活性急劇上升，在60 ℃達(dá)到最大值后，活性緩慢下降。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)臏囟瓤梢栽黾臃肿拥臒徇\(yùn)動(dòng)，加速分子間的運(yùn)動(dòng)與碰撞，從而促進(jìn)酶解效果。當(dāng)酶解溫度低于最佳溫度時(shí)，酶分子的活性降低，從而減少了酶與底物的接觸。當(dāng)酶解溫度高于其最佳溫度時(shí)，酶的結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致酶失活，最終導(dǎo)致酶解效果減弱[27?28]。因此酶解溫度為60 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)鈣螯合活性影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on calcium chelation activity

2.1.1.5 酶解時(shí)間對(duì)鈣螯合活性的影響 如圖5 所示，隨著酶解時(shí)間的延長，鈣螯合活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在初始階段水解，底物濃度高，酶解效果增加，但隨著酶解時(shí)間增加，水解的底物濃度低于初始體系，因此，反應(yīng)速率降低，鈣螯合活性也減少[29]。因此選取酶解時(shí)間為2、3 和4 h 進(jìn)行進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)鈣螯合活性影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on calcium chelation activity

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析 以底物濃度以及酶解時(shí)間和酶底比為自變量，鈣螯合活性為指標(biāo)設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。響應(yīng)面分析圖可以直觀地表明2 個(gè)因素間相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度，底物濃度（A）、酶解時(shí)間（B）、酶底比（C）3 個(gè)因素之間耦合作用對(duì)螯合活性的影響，如圖6所示。

圖6 底物濃度、時(shí)間、酶底比交互作用對(duì)鈣螯合活性的影響Fig.6 Effects of concentration of substance, time and enzyme to substrate ratio interaction on calcium chelation activity

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

由回歸方程模型的方差分析及顯著性分析結(jié)果（表3）可知，模型P值為0.0055（P<0.01），失擬項(xiàng)0.1086（P>0.05）不顯著，這表明模型顯著，試驗(yàn)誤差小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合度好。此外，R2的計(jì)算值為0.91，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果一致性良好，證明該模型結(jié)果可靠，可用此模型預(yù)測和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，方差分析還顯示，A、AC、C2對(duì)鈣螯合活性有顯著影響（P<0.05）。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Significant test and variance analysis for the regression model

以鈣螯合活性（Y）為響應(yīng)值的回歸方程為：

響應(yīng)面得到的最優(yōu)的酶解條件為底物濃度8%，時(shí)間2 h，酶底比0.3%，pH7，溫度60 ℃；鈣螯合活性預(yù)測37.62 μg/mL。驗(yàn)證結(jié)果鈣螯合活性為（38.31±0.4） μg/mL，與預(yù)測值相接近。

2.2 氨基酸分析

最優(yōu)條件下酶解物（羅非魚鱗鈣結(jié)合肽）及其肽鈣螯合物的氨基酸含量如表4 所示。與酶解物相比，在肽鈣螯合物中，甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸和絲氨酸的相對(duì)含量均出現(xiàn)不同程度的增加，其中增幅較大的是天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和組氨酸，分別增加0.88%、1.48%、0.53%、0.46%，這說明這些氨基酸存在與鈣離子結(jié)合的作用位點(diǎn)。研究表明，甘氨酸的α-氨基氮原子可與鈣結(jié)合[30]，天冬氨酸和谷氨酸的游離羧基，可以與鈣結(jié)合形成肽鈣螯合物[31]，賴氨酸的ε氨基氮與鈣有較強(qiáng)的結(jié)合能力[32]，而組氨酸的N 末端含咪唑環(huán)、絲氨酸的羥基以及半胱氨酸的巰基與鈣都有較強(qiáng)的結(jié)合能力[33?34]。

表4 氨基酸分析Table 4 Amino acid analysis

2.3 紫外吸收光譜分析

在紫外分光光度計(jì)中，金屬離子與有機(jī)配體形成復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致新的吸收峰的出現(xiàn)或原始吸收峰的轉(zhuǎn)移或消失[35]。從圖7 可以看出，羅非魚鱗鈣結(jié)合肽在220 nm、280 nm 附近處有高的吸收峰，這分別是肽鍵羰基和芳香族氨基酸殘基的特征吸收峰[34]。結(jié)合鈣后，肽鈣螯合物的吸收強(qiáng)度都增加。這是因?yàn)殡闹械娘@色基團(tuán)（C=O 和-COOH）和助色基團(tuán)（-NH2和-NH）空間結(jié)構(gòu)改變，引起紫外光譜強(qiáng)度變化[6]。現(xiàn)象說明羅非魚鈣結(jié)合肽與鈣結(jié)合產(chǎn)生新的物質(zhì)，并且可以推測-NH-和-NH2的氮原子和-C=O 和-COOH的氧原子參與了螯合作用。

圖7 紫外吸收光譜圖Fig.7 Ultraviolet absorption spectrogram

2.4 紅外吸收光譜分析

鈣離子螯合前后的紅外吸收峰的特征變化是反映金屬離子與有機(jī)配體基團(tuán)相互作用的有效證據(jù)[36?37]。如圖8 所示，鈣結(jié)合肽在3326.12 cm?1有一個(gè)強(qiáng)的吸收峰，螯合鈣離子之后，波數(shù)則變?yōu)?332.84 cm?1，這是因?yàn)檎T導(dǎo)效應(yīng)或偶極場效應(yīng)和肽中N-H 的電子云密度增強(qiáng)所致[38]，這也說明N-H 與鈣離子有一定的結(jié)合作用。鈣結(jié)合肽在1657.10 cm?1處的吸收帶主要是酰胺I（1700～1600 cm?1）的振動(dòng)。酰胺I 區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)：β-轉(zhuǎn)角，1660～1700 cm?1；α螺旋，1645～1659 cm?1；不規(guī)則結(jié)構(gòu)，1640～1644 cm?1；和β折疊，1620～1640 cm?1[39]。結(jié)合鈣后，波數(shù)（1657.10 cm?1）移至較低頻率（1648.65 cm?1），表明C=O 基團(tuán)參與了與鈣的共價(jià)鍵合反應(yīng)，且肽鈣螯合物形成α螺旋結(jié)構(gòu)。鈣結(jié)合肽中-COO 的波數(shù)（1400.65 cm?1）向更高的頻率（1412.09 cm?1）移動(dòng)，這可能是由于羰基氧的自由電子對(duì)螯合鈣離子，表明-COOH 可能與鈣結(jié)合[40]。在500～1000 cm?1范圍內(nèi)，與鈣結(jié)合后，幾個(gè)吸收峰發(fā)生了變化，這是由N-Ca 鍵取代C-H 鍵和N-H 鍵振動(dòng)引起的[41]?？偟膩碚f，羅非魚鱗鈣結(jié)合肽中的羧基氧和氨基氮等基團(tuán)參與了與鈣離子結(jié)合，形成了羅非魚鱗肽鈣螯合物。

圖8 肽（A）及肽鈣螯合物（B）的紅外光譜掃描圖譜Fig.8 Infrared spectra of peptides（A）and peptide-calcium chelate（B）

3 結(jié)論

本研究通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，獲得羅非魚鱗鈣結(jié)合肽的最優(yōu)酶解工藝條件（底物濃度8%、時(shí)間2 h、酶底比0.3%、pH7、溫度60 ℃），鈣螯合活性為（38.31±0.4）μg/mL。最優(yōu)酶解條件下制得的羅非魚鱗鈣結(jié)合肽及其肽鈣螯合物的表征結(jié)果表明，肽鈣螯合物中的天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、半胱氨酸及組氨酸含量增加，說明這些氨基酸在與鈣離子結(jié)合的過程起到關(guān)鍵作用；且鈣結(jié)合肽中的羧基氧和氨基氮等基團(tuán)參與了與鈣離子結(jié)合，形成肽鈣螯合物。本研究制備的羅非魚鱗鈣結(jié)合肽對(duì)于替代傳統(tǒng)的補(bǔ)鈣劑具有一定的市場優(yōu)勢和前景。