李曉娜 田慧勇 楊曉夏 陳明山 曹濤 李森

摘要：為探明水產飼料中真菌產毒的關鍵因素和毒素種類，采用真菌菌種接種不同水產飼料培養(yǎng)基在不同溫度、濕度、光照條件下，觀察其生長、產毒情況。結果表明：從不同環(huán)境因素下南美白對蝦飼料中真菌毒素的產生情況可以看出，在實驗環(huán)境條件下有五種毒素檢出，分別為玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A。該試驗中15天時4種不同水產飼料中黃曲霉毒素B1的含量與飼料中賴氨酸含量關聯度最大，其次為粗蛋白、粗灰分、粗纖維和水分。水產飼料中不同真菌毒素的發(fā)生條件不盡相同，飼料儲存需根據當地季節(jié)及氣候條件選擇適當的儲存條件來避免或盡可能降低真菌毒素帶來的污染。

關鍵詞：水產飼料;真菌毒素;環(huán)境影響;污染防控

中圖分類號：S963? ? ? ? 文獻標識碼：A

水產飼料業(yè)的成長基于水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展改革開放之后，上世紀80年代，以對蝦、河鰻、甲魚等為代表的名優(yōu)水產品養(yǎng)殖迅猛發(fā)展引人注目，為了與我國水產養(yǎng)殖的發(fā)展進程相匹配，上世紀90年代，我國水產飼料產業(yè)逐步成型，水產飼料商品已成為我國飼料行業(yè)發(fā)展的亮點。2018年中國水產飼料產量達2211萬噸，較2017年增加了131.2萬噸，同比增長6.31%，但2019年起中國水產飼料產量開始下滑，2020年中國水產飼料產量為2123.6萬噸，較2019年減少了79.3萬噸，同比減少3.60%[1]。

到目前為止，廣東省水產飼料中真菌毒素污染情況的報道非常少，由此以廣東省的水產飼料霉變情況作為研究對象更加具有代表性。水產飼料被真菌毒素污染大致可分為兩種情況，一是制造飼料的植物性原料被污染，二是成品飼料在儲存過程中被真菌污染后產生毒素[2，3]。成品飼料霉變過程往往是內因與外因共同作用的結果[4，5]。當環(huán)境條件適合真菌活動時，飼料霉變會在短期內發(fā)生[6-8];當常規(guī)儲藏條件下飼料本身因素適合真菌生長時，飼料霉變也會發(fā)生[9-10]。探明水產飼料中真菌產毒的關鍵因素將為真菌毒素在水產飼料中污染防控及進一步的研究提供理論依據。

1? 實驗材料及方法

1.1? 菌種

本實驗采用的菌種為購自廣東省菌種保藏中心的木賊鐮孢，編號：GIM3.506，其他編號：無;鮮綠青霉，編號：GIM3.505，其他編號：AS3.4517;寄生曲霉，編號：GIM3.395，其他編號：AS3.124;三線鐮孢菌，編號：GIM3.491，其他編號：AS3.4731;實驗室自分離菌株：黃曲霉;分離來源：霉變馬友魚干。

菌種的復蘇與培養(yǎng)：用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，將凍干管尖端放在火焰上加熱，滴少量無菌水至加熱處使之破裂，用銼刀或鑷子輕輕敲下安瓿管頂端，并將凍干管開口處在火焰上過1遍，并保持在火焰旁操作。用無菌吸管吸取0.2 mL無菌水，滴入管內，待安瓿管內的牛奶菌粉溶解呈懸浮狀，再用無菌吸管吸取全部菌懸液接在2個馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板培養(yǎng)基上，并在28℃培養(yǎng)3～5天。觀察PDA平板，使用接種針將單一的目標菌落接種至50 mL PDA肉湯中，在培養(yǎng)溫度為28℃，轉速為100 rpm的搖床培養(yǎng)8天。

1.2? 試劑

甲醇：色譜純;乙腈：色譜純;超純水由arium 611VF超純水機制備;氯化鉀、氯化鈉、硫酸鉀、正己烷、乙酸、氨水、乙醇均為分析純試劑;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），青島海博公司。

1.3? 實驗器材

液相色譜質譜聯用儀：TSQ Quantum Access，THERMO Fisher;電子分析天平：XS205，METTELER TOLEDO;可溫控超聲波提取器：HU-3120B，天津恒奧科技發(fā)展有限公司;旋渦混合器：VTX-3000L，vortex;漩渦震蕩器：Multi Reax，Heidolph;旋轉蒸發(fā)儀：Hei-VAP Value G3，Heidolph;離心機：上海安亭科學儀器廠;氨基酸自動分析儀：L-8900，HITACHI;冰箱：AQ-16L，先科;溫濕度計：9014，得力;低溫恒溫培養(yǎng)箱：LTI-700W;LED隨身燈。

1.4? 不同環(huán)境因素對水產飼料中真菌產毒的影響

選擇南美白對蝦配合顆粒飼料作為實驗飼料，將培養(yǎng)良好的菌株PDA肉湯接種至實驗飼料中。分別設置不同環(huán)境條件，考察真菌產毒情況。

1.4.1? 儲藏濕度的選擇

設置28℃條件下濕度為75%、84%、98%三個濕度區(qū)系，分別采用NaCl、KCl、K2SO4的飽和鹽溶液來維持環(huán)境的相對濕度。12小時光照，12小時避光儲藏。

1.4.2? 儲藏溫度的選擇

分別設置18℃、23℃、28℃三個溫度區(qū)系，濕度為84%，12小時光照，12小時避光儲藏。

1.4.3? 儲藏光照條件的選擇

設置1天內光照時長分別為24小時、12小時、0小時，溫度28℃，濕度84%儲藏。

1.4.4? 儲藏時間的選擇

分別于15天、30天、45天、60天、90天后將上述條件下儲藏的飼料取樣，按3.1方法檢測其中目標毒素含量。

1.5? 不同基質飼料中主要毒素種類

選擇南美白對蝦配合飼料、金鯧魚配合飼料、魚蝦混合全效配合飼料、草蝦配合飼料4種不同的水產配合飼料作為實驗飼料，接種3.3.1.1菌種后在溫度28℃，濕度84%條件下，12天光照，12天避光儲藏90天，分別于15天、30天、45天、60天、90天取樣，然后檢測其中目標毒素含量。

飼料典型成分分析方法：飼料中水分含量的測定參照GB/T6435-2014《飼料中水分的測定》;粗灰分參照GB/T6437-2007《飼料中粗灰分的測定》;粗蛋白參照GB/T6432-1994《飼料中粗蛋白測定方法》;賴氨酸參照GB/T18246-2000《飼料中氨基酸的測定》中酸提取法;粗纖維參照GB/T6434-2006《飼料中粗纖維的含量測定過濾法》。

2? 結果分析與討論

2.1? 不同環(huán)境因素對水產飼料中真菌產毒的影響

從不同環(huán)境因素下南美白對蝦飼料中真菌毒素的產生情況（表1）可以看到，在實驗環(huán)境條件下，在對目標毒素的檢測中有5種毒素檢出，分別為玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A。玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1及赭曲霉毒素A從第一次取樣（儲存15天）開始就檢出陽性，并且含量較高，說明在設置的實驗條件下，這三種毒素在短期內非常容易產生。T-2毒素和HT-2毒素則是在儲存90天后才檢出陽性，也就是說在設置的實驗環(huán)境下這兩種毒素的產生需要一定時間。赭曲霉毒素A在45天后的目標毒素檢測中結果為陰性，可能的原因是儲存過程中環(huán)境中其他微生物的作用將其降解或是產毒菌株在前期產生赭曲霉毒素A，后期產生或轉化為赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C等其他次生代謝產物。玉米赤霉烯酮（圖1）和黃曲霉毒素B1（圖2）的發(fā)生規(guī)律有些相似，均是在30～60天達到峰值后開始下降，這并不符合預想的遞增規(guī)律，可能原因是飼料在儲存過程中當水分和熱量在局部蓄積到一定程度，曲霉、青霉等適于中等水分和溫度的真菌開始增多并產毒，但進一步儲存過程中嗜熱型、濕生性的細菌、放線菌、霉菌就開始大量繁殖，這些微生物共同作用使得不同菌種間有一定的競爭抑制作用。加上在后期可能出現能夠降解真菌毒素的細菌或是產毒真菌被抑制后環(huán)境條件如光照等將產生的真菌毒素降解。但從飼料中菌落狀況來看，霉變程度隨著時間遞增越來越嚴重，雖然實驗條件下部分目標毒素有降低趨勢，但并不代表飼料品質可逆，因為檢測的目標毒素種類有限，微生物間作用機理復雜，目標毒素轉化為其他有毒物質或產生其他有毒次生代謝產物也是極有可能的。

當濕度為84%，溫度28℃，光照時長為12小時或24小時時，產生大量玉米赤霉烯酮所需時間最短，而當飼料儲存30天后產量處于峰值時的環(huán)境因素中毒素產量最高的條件分別為濕度75%，溫度23℃，光照時長12小時（圖1）。黃曲霉毒素B1產量處于峰值時的環(huán)境因素中產量最高的條件為濕度98%，溫度28℃，光照時長0小時（圖2）。

選擇玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1在45天，T-2毒素、HT-2毒素在90天，赭曲霉毒素A在30天時的產毒量進行灰色關聯度分析（表2～表6）。其中玉米赤霉烯酮與溫度條件關聯度最大，黃曲霉毒素B1與濕度條件關聯度最大，T-2毒素、HT-2毒素和赭曲霉毒素A與光照時長關聯度最大。所以不同毒素在水產飼料中的產毒條件并不相同，即水產飼料在儲存過程中應該根據當地氣候選擇適當的儲存條件來避免飼料中真菌毒素的發(fā)生。

2.2? 不同基質飼料中主要毒素種類

選擇90天內水產飼料中各毒素含量較大時的值作為參考數列xa，飼料的典型性狀作為比較數列xi（i=1，2，…，n）進行灰色關聯度分析（表7）。在進行灰色關聯度分析時，按公式（1）進行數據標準化處理，計算得到參考數列ya（k），比較數列yi（k）（k=1，2，…，m;i=1，2，…，n）。和S分別代表數列的均值和標準差。根據公式（2）求參考數列與比較數列的關聯系數。其中ρ為分辨系數，一般取值為0.5，為ya（k）與yi（k）的差值絕對值的最小值，為ya（k）與yi（k）的差值絕對值的最大值，按公式（3）計算關聯度，結果見表8。

從表7和表8可以看到，15天時4種不同水產飼料中黃曲霉毒素B1的含量與飼料中賴氨酸含量關聯度最大，其次為粗蛋白、粗灰分、粗纖維和水分，這與75天時玉米赤霉烯酮含量與飼料典型性狀間的關聯次序一致。即在溫濕度較高情況下一種飼料一旦被產毒真菌污染，就很可能同時被黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮污染。并且賴氨酸和蛋白含量高的飼料更容易被這兩種毒素污染。與T-2毒素與HT-2毒素含量關聯度最大的均為粗纖維含量，其次為水分含量。說明T-2毒素與HT-2毒素的發(fā)生規(guī)律與飼料中粗纖維和水分含量息息相關。而赭曲霉毒素A與飼料中粗灰分含量關聯度最大。所以不同毒素在同一環(huán)境條件下與飼料中典型性狀的相關性不盡相同，即不同飼料在儲存過程中易感真菌毒素種類有差異，防治工作需要針對性的進行。

3? 結論

水產飼料一旦被產毒真菌污染，在本實驗設置環(huán)境條件下赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮及黃曲霉毒素B1會在短期內迅速發(fā)生，T-2毒素及HT-2毒素的發(fā)生則需要一定時間。赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮及黃曲霉毒素B1的產生在30～60天達到最大值，之后有所下降甚至消失，其原因可能為目標毒素被其他微生物或環(huán)境條件降解，也可能是產毒菌株自身作用轉化為其他次生代謝產物。

水產飼料中不同真菌毒素的發(fā)生條件不盡相同，飼料儲存需根據當地季節(jié)及氣候條件選擇適當的儲存條件來避免或盡可能降低真菌毒素帶來的污染。不同水產飼料易感真菌毒素種類有差異，但黃曲霉毒素B1與玉米赤霉烯酮發(fā)生規(guī)律相似，高含量賴氨酸及蛋白的飼料更易感染這兩種真菌毒素。T-2毒素與HT-2毒素發(fā)生規(guī)律相似，粗纖維含量高的飼料易感染。赭曲霉毒素A則與飼料中粗灰分含量最相關。所以飼料在儲存階段真菌毒素的防治工作需有針對性的進行。

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