張瓊月，熊 躍，李冰寒，李林輝

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009)

隨著人們生活水平的不斷改善，餐飲行業(yè)也隨之欣欣向榮，但相關(guān)產(chǎn)業(yè)背后產(chǎn)生的油脂廢水也不斷增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)中大型城市每天產(chǎn)生的油脂廢水可高達(dá)300多萬(wàn)t[1]，加之不正當(dāng)、不合理的污水處理與廢水排放，不合法的油脂廢水回收再利用，對(duì)社會(huì)環(huán)境與生態(tài)環(huán)境、食品安全甚至人類安全都造成了極大的威脅[2-3]，油脂廢水的合規(guī)處理與合理回收利用也成為社會(huì)各界關(guān)注的重點(diǎn)。

當(dāng)下看來(lái)，處理油脂廢水的主流方式包括物理法、化學(xué)法和生物法[4]三大類。其中物理法和化學(xué)法由于投資較大、占地面積廣、流程復(fù)雜、且容易產(chǎn)生二次污染等不足，實(shí)際應(yīng)用于大規(guī)模處理油脂廢水的情況較少；而生物法因其處理過程成本低、效率高，且不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)而深受業(yè)內(nèi)人士青睞[5-6]。簡(jiǎn)言之，生物法處理油脂廢水，即利用具有油脂降解能力的微生物，將油脂作為其生長(zhǎng)發(fā)育所必需的碳源和能源，通過微生物生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的脂肪酶等降解酶系，先將油脂初步水解為甘油、脂肪酸，最終分解氧化為無(wú)污染的水、二氧化碳等代謝產(chǎn)物，達(dá)到快速便捷分解處理油脂且不造成二次污染的最終目的。經(jīng)過學(xué)者大量的篩選和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知[7-8]，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一類具有分解油脂能力、分布廣泛的微生物，常見于土壤、灰塵和污水當(dāng)中[9]。蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生大量芽孢以抵御不良生長(zhǎng)條件，環(huán)境合適時(shí)，芽孢又能快速萌發(fā)形成成熟的桿菌，產(chǎn)生大量脂肪酶分解利用環(huán)境中的脂類以滿足生命活動(dòng)所需?；诖朔N特性，蠟樣芽胞桿菌滿足制備干燥解脂劑所需要的保存時(shí)間久、活性恢復(fù)快、產(chǎn)物安全、無(wú)二次污染等一系列要求。

本文將實(shí)驗(yàn)室前期鑒定并保存的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行活化，在測(cè)定菌株解脂能力之后，制備成為具有高脂肪酶活性的解脂劑，在使用時(shí)只需要將解脂劑進(jìn)行快速活化便可以大量投入使用，快速有效地降低油脂廢水所帶來(lái)的種種危害。本研究所關(guān)注的解脂微生物制劑的研究與制備，對(duì)于處理油脂廢水、生態(tài)環(huán)境保護(hù)及其相關(guān)問題具有重要且深刻的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)室保存的蠟樣芽胞桿菌4號(hào)、7號(hào)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、解脂培養(yǎng)基(以10%體積的菜籽油替代LB液體培養(yǎng)基中的蛋白胨，且pH值調(diào)節(jié)至7.0)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株解脂能力探究 將蠟樣芽胞桿菌4號(hào)、7號(hào)菌株分別接種于LB固體培養(yǎng)基上，30℃活化培養(yǎng)；再轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，以30℃、140r/min進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)測(cè)得菌株OD600值為0.3～0.6時(shí)[10]，分別接種1mL菌液于100mL解脂培養(yǎng)基中，30℃、140r/min振蕩培養(yǎng)1d。觀察對(duì)比上層油脂顏色變化，油脂顏色越淺說明菌株的解脂能力越強(qiáng)，選擇解脂能力更強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)配制解脂劑的試驗(yàn)。

1.2.2 解脂劑配方篩選 干劑制備。將麩皮、谷殼按重量比10∶1的比例配制，調(diào)水至100%～120%，再分別添加重量比例為調(diào)水后麩皮谷殼重量1%、2%、3%、5%、10%的純菜籽油進(jìn)行攪拌并混合均勻。培養(yǎng)料以50g每份進(jìn)行分裝，121℃滅菌20min，冷卻后用OD600值為0.3～0.6的菌液按0.1mL/g的比例進(jìn)行接種，30℃恒溫培養(yǎng)，期間每12h將培養(yǎng)料混勻1次，每24h取樣檢測(cè)脂肪酶活力，直至培養(yǎng)結(jié)束。培養(yǎng)完成后將培養(yǎng)料于40℃下烘干至恒重，密封避光保存?zhèn)溆眉纯?。脂肪酶活力測(cè)定[11]。取1g培養(yǎng)料用無(wú)菌水振蕩洗脫以獲取酶液，采用指示劑滴定法測(cè)定其中脂肪酶的活力，計(jì)算公式如下[12]：U=(V-V0)/15×50×n其中U為樣品的酶活力(u/g)；V為滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；V0為滴定空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株解脂能力的初步判定

與空白對(duì)照組上層分布均勻的金黃色油脂相比，實(shí)驗(yàn)組上層油脂變?yōu)闇\黃色，且下層培養(yǎng)基變渾濁。顏色的差異表明實(shí)驗(yàn)組的部分油脂被消耗，證明具有解脂能力的蠟樣芽胞桿菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生脂肪酶并分解了油脂，并且接種4號(hào)菌株的上層油脂顏色更淺，油脂被分解得更加充分，說明4號(hào)菌株的解脂能力強(qiáng)于7號(hào)菌株，故后續(xù)采用蠟樣芽胞桿菌4號(hào)菌株進(jìn)行解脂劑的制備。

圖1 脂肪酶活力的測(cè)定結(jié)果

2.2 脂肪酶活性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)測(cè)定結(jié)果來(lái)看，菜籽油的加入量為調(diào)水麩皮谷殼重量的5%時(shí)，解脂制劑的脂肪酶活性最為優(yōu)異。從圖1可知，菜籽油添加量為5%和10%的情況下，從第1天到第6天蠟樣芽胞桿菌所產(chǎn)生脂肪酶的活性均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，最高可達(dá)4399u/g；而其余3個(gè)試驗(yàn)組在培養(yǎng)5d后酶活便到達(dá)頂峰，雖耗時(shí)稍短但峰值較低，尚不足以達(dá)到制劑所需要的標(biāo)準(zhǔn)?？傮w來(lái)說，隨著菜籽油添加量比例的增加，其配方更有益于蠟樣芽胞桿菌生產(chǎn)脂肪酶，脂肪酶活性也越強(qiáng)；但分析可知，當(dāng)油脂比例過高時(shí)，在一定程度上會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致菌株產(chǎn)酶能力下降，故菜籽油添加量為10%時(shí)的總脂肪酶活力反而不如5%。

3 結(jié)論

解脂能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蠟樣芽胞桿菌具有解脂能力，且4號(hào)菌株更適宜用于制備解脂劑。添加不同比例菜籽油的配方實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，采用麩皮、谷殼重量比10∶1并調(diào)水至100%～120%，再添加5%菜籽油的配方，接種OD600值為0.3～0.6的蠟樣芽胞桿菌菌液，在30℃下培養(yǎng)6d，再于40℃烘干至恒重，即可獲得具有高脂肪酶活性的解脂劑，其最高活力可達(dá)4399u/g。在脂肪酶活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，油脂的添加在一定程度上可以促進(jìn)解脂菌如蠟樣芽胞桿菌的生長(zhǎng)，但油脂比例過高反而使得其產(chǎn)脂肪酶能力下降，這也使得我們加深了對(duì)適度一詞的理解。對(duì)環(huán)境的利用與保護(hù)也是緊緊聯(lián)系著適度二字，只有全心全意地保護(hù)環(huán)境，才能得到大自然的美麗饋贈(zèng)。