■產(chǎn)啟霞 王福強* 憨素連 李 坤

（1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧大連 116023；2.大連大學醫(yī)學院，遼寧大連 116622）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）原產(chǎn)于歐洲，適宜在低溫環(huán)境生活，是我國北方重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖品種之一[1-2]。日益發(fā)展的大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)面臨著患病率高的突出問題，這極大地限制了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-7]。

益生菌是一種通過改善動物周圍環(huán)境或增強動物對疾病應答力的活菌制劑[8-10]，已經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應用[11-12]。研究表明，芽孢桿菌能顯著提高病原菌哈氏弧菌感染蝦的成活率[13]，當大菱鲆仔魚被病原弧菌感染時，乳酸菌能有效降低其死亡率[14]。然而，關于復合益生菌對大菱鲆免疫及抗病力的影響知之甚少。本研究在飼料中添加不同比例的由枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和酵母菌等復合而成的益生菌，評估其對大菱鲆幼魚免疫和抗病力的影響，旨在為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用大菱鲆幼魚由大連天正實業(yè)有限公司提供，運往大連海洋大學暫養(yǎng)7 d后在遼寧省水生生物學重點實驗室進行試驗。

復合益生菌粉由大連陽光白奧科技有限公司提供，由枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，（6.7±1.8）×107CFU/g]、嗜酸乳桿菌[Lactobacilli acidophilus，（2.1±0.6）×108CFU/g]和釀酒酵母[Saccharomyces cerevisiae，（8.4±2.3）×106CFU/g]組成?；罹鷶?shù)計算采用稀釋平板法[15]。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

將375尾體重為(8.94±0.02)g大菱鲆幼魚隨機分成5組：Z0組為對照組，飼喂基礎飼料；Z1、Z2、Z3、Z4組為試驗組，分別投喂含復合益生菌粉0.2%（2 g/kg）、0.4%（4 g/kg）、0.6%（6 g/kg）、0.8%（8 g/kg）的飼料，每組3個重復，每個重復25尾魚。所有飼料原料經(jīng)粉碎后過80目篩，按飼料配方稱重，混合均勻，再加入適量的水。用JZL型擠壓造粒機（購自常州品正干燥設備有限公司）制作直徑為2.0 mm的飼料，在室內(nèi)陰干后（低于20℃）置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆??；A日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧配方及營養(yǎng)水平（%）

試驗在循環(huán)控溫養(yǎng)殖水槽（100 cm×60 cm×30 cm）中進行，養(yǎng)殖期間全天充氣，水溫控制在（18±1）℃，pH為7.35～7.42、鹽度為30.6‰～31.2‰。每天以幼魚體重的3%投喂日糧，根據(jù)攝食情況適當調(diào)整飼喂量，達到飽食投喂，每天飼喂2次（分別為8：00和17：00），投喂后0.5 h清理殘餌糞便，并換水1/2，養(yǎng)殖周期為60 d。

1.2.2 樣品采集

試驗結束前對大菱鲆幼魚進行24 h饑餓處理，隨機從各組中選取5尾大菱鲆，尾靜脈取血（3～4 mL），用低溫離心機離心（12 000 r/min，15 min）后取血清，置于-80℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫指標的測定

大菱鲆血清的溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和總抗氧化力（T-AOC）測定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。

1.2.4 攻毒試驗

60 d飼養(yǎng)結束后對試驗組和對照組的大菱鲆進行為期14 d的攻毒試驗，攻毒菌株為遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda），菌株來自大連海洋大學病害實驗室。分別從各水槽取13尾魚，采用腹腔注射法每尾魚注射0.1 mL菌懸液（1×108CFU/mL），攻毒試驗期間大菱鲆停止飼喂，記錄各組魚在7 d和14 d內(nèi)的累積死亡率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

試驗使用SPSS 22.0軟件和Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，在差異顯著時，采用Duncan’s法對平均數(shù)進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌粉對大菱鲆幼魚免疫酶活性的影響（見表2）

表2 復合益生菌粉對大菱鲆免疫酶活性的影響(N=3)

由表2可知，與Z0組相比，Z1、Z2、Z3組中的大菱鲆血清ACP活性有增高的趨勢，但差異不顯著（P>0.05）。Z4組ACP活性和Z0組相比也沒有顯著差異（P>0.05），但卻顯著低于Z1、Z2、Z3組（P<0.05）。

Z2組大菱鲆血清AKP活性顯著高于Z0組和其他試驗組（P<0.05）。Z3組大菱鲆血清LZM活性顯著高于Z0組（P<0.05），但和其他試驗組差異不顯著（P>0.05）。

各試驗組的大菱鲆血清CAT活性均顯著高于Z0組（P<0.05），Z2、Z3組也顯著高于Z1、Z4試驗組（P<0.05）。Z1、Z2、Z3組的大菱鲆血清SOD活性顯著高于Z0組和Z4組（P<0.05），但Z1、Z2、Z3組之間差異不顯著（P>0.05）。

Z1、Z2、Z3組的大菱鲆血清T-AOC顯著高于Z0組（P<0.05），且Z3組大菱鲆血清T-AOC也顯著高于其他試驗組（P<0.05），其他試驗組之間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 復合益生菌粉對大菱鲆幼魚攻毒試驗的影響（見表3、圖1）

圖1 復合益生菌粉對大菱鲆抗病力的影響

表3 不同復合益生菌粉添加量對攻毒后大菱鲆成活率的影響(N=3，%)

如表3所示，飼料中添加復合益生菌粉對攻毒7 d和14 d的大菱鲆存活率均有影響。Z0組和Z4組在攻毒7 d后，大菱鲆幼魚的成活率顯著低于Z1、Z2、Z3組（P<0.05）。Z0組和Z4組在攻毒14 d后，大菱鲆幼魚的成活率也顯著低于Z1、Z2、Z3組（P<0.05）。

由圖1和表3可見，在大菱鲆幼魚注射遲鈍愛德華菌的前5 d，Z1、Z2、Z3組沒有死亡，而Z0組和Z4組的大菱鲆死亡率達到35%以上。攻毒7 d后，Z1、Z2、Z3組的大菱鲆幼魚存活率仍然在90%左右，而Z0組的大菱鲆存活率不到20%。攻毒14 d后，Z0組和Z4組的大菱鲆已幼魚全部死亡，而Z1、Z2、Z3組的大菱鲆成活率仍然有40%～50%左右?？偟内厔菔?，隨著復合益生菌添加量的增加，大菱鲆累積死亡率逐漸下降，達到最小值后又上升。這表明復合益生菌粉對用遲鈍愛德華菌攻毒的大菱鲆幼魚有一定的保護作用。

3 討論

3.1 復合益生菌粉對大菱鲆幼魚免疫酶活性的影響

魚類的非特異性免疫比特異性免疫系統(tǒng)更重要，尤其在抗病能力上更是如此[16]。LZM是水產(chǎn)動物重要的非特異性免疫因子之一，存在于組織、體液和分泌物中。是水生動物對抗傳染性病原體至關重要的工具酶[17]。AKP和ACP是溶酶體酶的重要組成部分，在生物體免疫反應中具有重要作用[18]。魚體內(nèi)有天然的抗氧化系統(tǒng)，如CAT和SOD等是水生動物重要的抗氧化酶，可通過清除氧自由基來阻止生物分子損傷[19-20]。抑制脂質過氧化產(chǎn)物形成的指標可由TAOC表示[21]。這些免疫相關酶與抗氧化酶作為魚體免疫系統(tǒng)的組成部分，其活性的高低直接反映了魚體非特異性免疫防御能力。

研究證實，單種益生菌可以提高水生動物的LZM水平。乳酸乳球菌、清酒乳桿菌、腸膜明串珠菌可以使褐鱒（Salmo trutta）血清LZM水平升高[22]。在飼料中添加高劑量的滅活乳桿菌同樣能提高刺參（Apos?tichopus japonicus）AKP的活性[23]。凡納濱對蝦（Litope?naeus vannamei）日糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高血清SOD和T-AOC活性[24]。把枯草芽孢桿菌直接投入水體中也能提高魚類的血清T-AOC[25]。這些研究表明益生菌能提高水產(chǎn)動物血清的免疫酶活性。然而，復合益生菌粉是否能夠進一步對大菱鲆非特異性免疫防御能力有改善作用仍鮮見報道。本研究表明，飼料中添加復合益生菌粉能夠提高大菱鲆血清LZM、ACP、AKP、CAT、SOD活性和T-AOC，尤其是添加量為0.6%時效果最為顯著。刺參飼料中添加6 g/kg的復合益生菌顯著提高了刺參體腔液的ACP活性，而其他添加量則對ACP活性沒有顯著影響，投喂復合益生菌組的刺參體腔液中CAT活性與對照組也沒有顯著差異[26]。這可能與益生菌的種類、試驗水產(chǎn)動物種類以及添加量有關。

3.2 復合益生菌粉對大菱鲆抗病力的影響

遲鈍愛德華菌是一種能引起水產(chǎn)動物腹水癥的致病菌，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已引起了20多種魚類患病，如鰻鱺（Anguilla spp）、中華鱉（Trionyx sinensis）、牙鲆（Paralichthys olivaeus）等，造成了巨大損失。本試驗發(fā)現(xiàn)添加0.2%～0.6%的復合益生菌粉，將攻毒后大菱鲆成活率提高到90%左右，而對照組不到20%。這表明在飼料中添加復合益生菌能增強大菱鲆幼魚的抗病力。這些結果和徐琴等[27]的研究一致，其發(fā)現(xiàn)在中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）養(yǎng)殖中用鰻弧菌攻毒后，添加微生物制劑的3個試驗組的中國明對蝦存活率都顯著高于對照組。同樣，用哈維氏弧菌對凡納濱對蝦攻毒后，益生菌組的凡納濱對蝦死亡率顯著低于對照組[28]。大菱鲆攻毒后的存活與非特異性免疫酶和抗氧化酶活性的變化趨勢基本一致，這有力地表明復合益生菌能通過提高大菱鲆的非特異性免疫防御能力，從而明顯改善其生存狀況。

4 結論

飼料中添加復合益生菌粉能增強大菱鲆免疫酶活性和抗病力。復合益生菌粉添加量為0.6%時，大菱鲆幼魚的免疫酶活性和抗病力達到最佳狀態(tài)。