■王眾申 姜海龍*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118）

近年來，隨著節(jié)糧型養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)越來越受到重視，乙醇加工副產(chǎn)物的玉米酒精糟（DDGS）逐漸重新得到了重視[1]。但由于DDGS不可消化纖維含量較高和不可利用蛋白（如不溶性蛋白）水平高等因素，嚴(yán)重制約了其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用[2]。目前，在提高DDGS對豬的飼養(yǎng)價(jià)值方面，微生物發(fā)酵技術(shù)是主要的技術(shù)體系。但發(fā)酵的目的主要針對DDGS中不可被單胃動(dòng)物直接利用的纖維素和半纖維素的降解，而對于其中的不可溶性蛋白的結(jié)構(gòu)優(yōu)化報(bào)道較少。研究表明，單一的枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的特異性蛋白酶可以將不可溶蛋白（如醇溶蛋白）分解成肽，改變其營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，充分提高蛋白質(zhì)的利用效率[3]。在Romero等[4]的研究中發(fā)現(xiàn)，利用玉米DDGS作為地衣芽孢桿菌的唯一碳源和氮源，可以生產(chǎn)蛋白酶。且枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌作為具有明確益生菌作用的物種，能夠產(chǎn)生代謝物，如短鏈脂肪酸、丙酸、丁酸、溶菌酶[5]。如何將這兩種菌的發(fā)酵程度有機(jī)地結(jié)合在一起，既能充分降解DDGS中的不可溶蛋白質(zhì)，又能維持在一定的碳/氮消耗上，保持發(fā)酵的生態(tài)平衡，是這方面的研究熱點(diǎn)之一。本研究利用響應(yīng)面試驗(yàn)方法[6-8]，以DDGS發(fā)酵過程中的醇溶蛋白含量為響應(yīng)值，對枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌復(fù)合作用下的DDGS發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從而達(dá)到降低DDGS中醇溶蛋白含量，提高DDGS利用率，為后續(xù)深入研究復(fù)合菌DDGS發(fā)酵飼料提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌BS2株和地衣芽孢桿菌BL1株，均由動(dòng)物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并且保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基：牛肉浸粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，自然pH，121℃滅菌15 min。

1.1.3 培養(yǎng)基原料與化學(xué)試劑

DDGS（粗蛋白含量25.21%），玉米蛋白粉、麥麩，均為市售（粉碎后過40目篩）；蔗糖購于北京化學(xué)試劑公司；FeSO4、MgSO4、KH2PO4（均為分析純）購于北京化學(xué)試劑公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備

菌種活化：將甘油保藏的菌株BS2和BL1接種于NB液體培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培12 h備用。

種子液制備：將培養(yǎng)好的菌株稀釋至OD620nm=0.5，并以4%接種量接入裝有100 mL NB液體培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，制備成種子液。

1.2.2 醇溶蛋白的測定

將原料過60～80目篩后在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡（液固比4∶1）置于60℃搖床（125 r/min）萃取2 h，置于離心機(jī)100 r/min離心分離10 min，取上清液。將得到的提取液回收乙醇，利用0.22μm混合膜過濾，得到濕產(chǎn)物后利用凱氏定氮法測定醇溶蛋白的含量。

1.2.3 DDGS發(fā)酵培養(yǎng)基組分范圍的篩選

利用上述準(zhǔn)備好的接種物對DDGS進(jìn)行發(fā)酵，具體過程如下：首先，取DDGS 20 g，麥麩、玉米蛋白粉、蔗糖、含水量、KH2PO4、FeSO4、MgSO4按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，溫度均設(shè)置為37℃，定量加入250 mL的錐形瓶中，添加水為70℃無菌水，攪拌均勻后，放入干熱滅菌器中進(jìn)行滅菌，65℃，1 h（參照動(dòng)物微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)所述巴氏消毒法進(jìn)行）；然后，保溫1 h后按照10%接入菌種，混合發(fā)酵48 h，樣品采用65℃烘干至恒重。烘干后的樣品利用研缽進(jìn)行研磨，并保存于-20℃冰箱中。含水量是在添加不同重量組分后確定的總含水量。在以DDGS為底物設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案如表1～表7所示。

表1 麥麩對DDGS醇溶蛋白的影響

表2 玉米蛋白粉對DDGS醇溶蛋白的影響

表3 蔗糖對DDGS醇溶蛋白的影響

表4 含水量對DDGS醇溶蛋白的影響

表5 KH2PO4對DDGS醇溶蛋白的影響

表6 FeSO4對DDGS醇溶蛋白的影響

表7 MgSO4對DDGS醇溶蛋白的影響

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，確定枯草芽孢桿菌BS2和地衣芽孢桿菌BL1的比例為1∶1，添加量為5%，本試驗(yàn)選取麥麩（%）、玉米蛋白粉（%）、蔗糖（mg/kg）、KH2PO4（mg/kg）、FeSO4（mg/kg）、MgSO4（mg/kg）、含水量（%）、溫度（℃）共8個(gè)因素的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素選高低2個(gè)水平，以（-1，+1）編碼各值［9］，各因素及取值見表8。以發(fā)酵后DDGS醇溶蛋白含量為響應(yīng)值，運(yùn)用N=12的Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)快速篩選對菌株組合生長影響顯著的因素。

表8 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，篩選出顯著影響因素，根據(jù)回歸方程系數(shù)來確定爬坡方向，“+”表示正相關(guān)，“-”表示負(fù)相關(guān)，通過最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面中心點(diǎn)[10-11]。

1.2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出顯著影響因素蔗糖（mg/kg，C）、KH2PO4（mg/kg，D）、含水量（%，G），以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果中最大響應(yīng)值所對應(yīng)的各因素水平為基準(zhǔn)，確定響應(yīng)面的中心點(diǎn)。采用Box-Behnk?en試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化DDGS的發(fā)酵條件[12]，并利用De?sign-Expert 10.0.7對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子與水平見表9。在確定最優(yōu)條件后，在該條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證平行試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際條件確定實(shí)際最優(yōu)條件（發(fā)酵方法見步驟1.2.3）。

表9 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果均采用IBM SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。響應(yīng)面試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果均用運(yùn)用Design-Expert 10.0.7軟件進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過糖發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌利用蔗糖的能力較強(qiáng)，且一般的枯草芽孢桿菌作為固態(tài)發(fā)酵菌種對KH2PO4、MgSO4和FeSO4等無機(jī)鹽具有一定的需求[13-14]。同時(shí)由于枯草芽孢桿菌對于氧氣的需求量較大且單純依靠DDGS恐無法完全提供足夠的氮源，因此需要考慮麥麩和玉米蛋白粉的添加。由于發(fā)酵過程中主要底物為DDGS，其發(fā)酵產(chǎn)物中醇溶蛋白的含量應(yīng)是相應(yīng)的減少。由圖1可見，當(dāng)麥麩添加量逐漸升高時(shí)，醇溶蛋白的含量是存在波動(dòng)的，當(dāng)添加量為4%時(shí)，達(dá)到最低點(diǎn)。但是，在添加量達(dá)到9%時(shí)，醇溶蛋白的含量又出現(xiàn)了下降。但是，均沒有超過4%的最低點(diǎn)。所以，初步確定麥麩的添加量為4%～10%。隨著玉米蛋白粉的含量升高時(shí)，醇溶蛋白含量波動(dòng)明顯，并且在14%時(shí)達(dá)到最大值，在19%時(shí)達(dá)到最小值。由于玉米蛋白粉的過量添加會(huì)造成發(fā)酵DDGS的品質(zhì)下降，初步確定玉米蛋白粉的添加量范圍為10%～19%。當(dāng)蔗糖添加量變化時(shí)，醇溶蛋白的整體含量波動(dòng)較大，尤其是在3～6 mg/kg時(shí)變化趨勢明顯，在5 mg/kg出現(xiàn)明確拐點(diǎn)。由于蔗糖是成本較高的碳源，綜合考慮試驗(yàn)數(shù)據(jù)和成本，確定添加蔗糖的比例為3～6 mg/kg。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)上判斷，含水量以90%為最佳。但是，根據(jù)回歸方程，呈整體下降趨勢，所以確定含水量范圍為90%～100%，兼顧了組合間的活性、物料的透氣性和枯草芽孢桿菌的需氧性。

圖1 單因素試驗(yàn)篩選范圍

在發(fā)酵過程中，K+、Fe2+和Mg2+等存在頡頏作用，綜合發(fā)酵效果，確定KH2PO4添加范圍為0.2～0.5 mg/kg；FeSO4的添加量在0.1～0.2 mg/kg最為合適；MgSO4的添加量在0.1～0.2 mg/kg最為合適。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選重要影響因素

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按1.2.4中的方法進(jìn)行N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表10。在分析結(jié)果表11中可以發(fā)現(xiàn)，影響發(fā)酵效果的因素大小順序?yàn)椋汉浚℅）>蔗糖（C）>KH2PO4（D）>FeSO4（E）>Mg?SO4（F）>麥麩（A）>溫度（H）>玉米蛋白粉（B）。模型P=0.038 8<0.05，Plackett-Burman模型顯著；含水量P=0.009 9<0.01，對Plackett-Burman模型影響極顯著；蔗糖、KH2PO4的P<0.05，對Plackett-Burman影響顯著。

表10 Plackett-Burman設(shè)計(jì)與結(jié)果

表11 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析

一次回歸方程為:

Y=0.23+0.083×A+0.050×B-0.17×C-0.083×D-0.072×E+0.12×F+0.30×G-0.057×H

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果篩選出KH2PO4、蔗糖、含水量3個(gè)顯著影響因素，通過最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表12。當(dāng)KH2PO4添加量為0.4 mg/kg、蔗糖添加量為5 mg/kg、含水量為95%時(shí)，對應(yīng)試驗(yàn)3的醇溶蛋白含量達(dá)到最小。試驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)增加營養(yǎng)物質(zhì)及調(diào)整生長條件有利于提高菌株組合對于醇溶蛋白的分解，超出某一臨界值將抑制菌株組合的生長，從而限制菌株組合對醇溶蛋白的分解能力。因此，選取試驗(yàn)3對應(yīng)條件作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)，即KH2PO4添加量為0.4 mg/kg、蔗糖添加量為5 mg/kg、含水量為95%。

表12 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

響應(yīng)面試驗(yàn)是根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)選取的中心點(diǎn)，利用少量的試驗(yàn)總結(jié)影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，同時(shí)分析各因素之間的交互作用。根據(jù)響應(yīng)面中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表14。

表13 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

表14 回歸模型方差分析

以醇溶蛋白為響應(yīng)值的二次回歸方程:

Y=0.11+0.002 888×A-0.024×B+0.039×C-0.002 9×A×B+0.044×A×C-0.042×B×C+0.001 86×A2+0.013×B2+0.001 235×C2

由表15可知，回歸模型分析結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)的顯著性是由較大的F和較小的P所表達(dá)的[14]。通過方差分析模型的P>F<0.01即可視為該模型是極顯著的，擬合精度達(dá)到預(yù)期，并且可以利用該響應(yīng)面近似模型對本試驗(yàn)進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)。失擬項(xiàng)P>F>0.05，即失擬項(xiàng)為13.51，失擬項(xiàng)P=0.054 4>0.05，說明影響不顯著，試驗(yàn)所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例較小；即：該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好。多元相關(guān)系數(shù)R2的大小直接決定了相關(guān)性的優(yōu)劣，多元系數(shù)R2越大，說明相關(guān)性越好；Adj R-Squared和Pred R-Squared這兩個(gè)值直接作用于回歸模型能否充分解釋工藝過程。二者高且接近（RAdj 2-RPred 2<0.2），則回歸模型能充分說明工藝過程；反之，則說明回歸模型對工藝解釋不充分，需考慮是否存在其他顯著的影響因子。在本模型中，二者差值小于0.2，即本回歸模型可以解釋本試驗(yàn)工藝。

表15 回歸方程誤差統(tǒng)計(jì)分析

C.V.作為表明試驗(yàn)的可信度和精確度重要參考依據(jù)，本回歸模型C.V.<10%=7.66%，說明本試驗(yàn)的可信度和精密度高。精密度（Adeq Precision）是有效信號(hào)與噪聲的比值，大于4視為合理。在本試驗(yàn)中精密度為27.911遠(yuǎn)大于4，即本回歸模型精密度可行。所以，擬合的回歸方程符合以上檢驗(yàn)原則，適應(yīng)性較好。

通過圖2可以進(jìn)一步驗(yàn)證該模型適應(yīng)性的優(yōu)劣。若模型適應(yīng)性好，則殘差的正態(tài)概率分布應(yīng)在一條直線上；殘差與預(yù)測值分布無規(guī)律；殘差與預(yù)測值分布圖盡可能在一條直線上。根據(jù)圖2可以看出，該模型適應(yīng)性好。

圖2 殘差的正態(tài)概率分布(A)、殘差與預(yù)測值分布(B)、預(yù)測值與實(shí)際值分布(C)

KH2PO4含量、含水量及蔗糖含量這3個(gè)因素中兩兩相互作用對醇溶蛋白的影響結(jié)果見圖3。其中，含水量(A)與蔗糖含量(C)交互作用顯著。當(dāng)含水量在較低水平時(shí)，對應(yīng)的蔗糖含量為在6.62 mg/kg；當(dāng)含水量增加時(shí)，對應(yīng)的蔗糖含量在1.99 mg/kg。由此可知，含水量與蔗糖含量交互作用呈負(fù)相關(guān)，最優(yōu)條件范圍內(nèi)，調(diào)節(jié)含水量與蔗糖含量的關(guān)系可調(diào)節(jié)DDGS發(fā)酵過程中的醇溶蛋白含量。KH2PO4的含量（B）與蔗糖含量（C）交互作用顯著，當(dāng)KH2PO4含量在較低水平時(shí)，對應(yīng)的蔗糖含量為1.99 mg/kg；當(dāng)KH2PO4含量增加時(shí)，對應(yīng)的蔗糖含量為6.62 mg/kg，由此可知KH2PO4含量與蔗糖含量交互作用呈正相關(guān)，最優(yōu)條件范圍內(nèi)，調(diào)節(jié)KH2PO4含量與蔗糖含量的關(guān)系可調(diào)節(jié)DDGS發(fā)酵過程中的醇溶蛋白含量。此外，從等高線圖可以看出圖形呈橢圓型，交互作用顯著[15]。

圖3 KH2PO4含量(A)、含水量(B)及蔗糖含量(C)對醇溶蛋白含量影響的響應(yīng)面和等高線

根據(jù)上述分析及Design-Expert 10.0.7預(yù)測，關(guān)于DDGS的最佳發(fā)酵條件為麥麩含量為9.95%、玉米蛋白粉含量為10.05%、蔗糖含量為6 mg/kg、KH2PO4含量為0.5 mg/kg、FeSO4含量為0.2 mg/kg、MgSO4含量為0.1 mg/kg、含水量為90%、溫度30.09℃。為驗(yàn)證該模型預(yù)測的可靠性，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際培養(yǎng)條件，麥麩含量為10%、玉米蛋白粉含量為10%、蔗糖含量為6 mg/kg、KH2PO4含量為0.5 mg/kg、FeSO4含量為0.2 mg/kg、MgSO4含量為0.1 mg/kg、含水量為90%、溫度30℃。實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果顯示，醇溶蛋白含量為4.88 mg/100 mL，與響應(yīng)曲面擬合所得方程的預(yù)測值相近，說明該模型較為合理。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，DDGS發(fā)酵之后的醇溶蛋白含量明顯減少，含量可達(dá)4.88 mg/100 mL，較優(yōu)化前12.69 mg/100 mL，降低了7.81 mg/100 mL，為后續(xù)深入研究DDGS發(fā)酵飼料提供了良好的研究基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以醇溶蛋白含量為響應(yīng)值，結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，DDGS最佳發(fā)酵條件為麥麩含量為10%、玉米蛋白粉含量為10%、蔗糖含量為6 mg/kg、KH2PO4含量為0.5 mg/kg、FeSO4含量為0.2 mg/kg、MgSO4含量為0.1 mg/kg、含水量為90%、溫度30℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，DDGS的醇溶蛋白含量達(dá)4.88 mg/100 mL，較優(yōu)化前12.69 mg/100 mL，降低了7.81 mg/100 mL。