■曹春紅 王海燕 李 爽 張廣民 蔡輝益

（1.天津博菲德科技有限公司，天津 301906；2.北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，北京 100081；3.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081）

植酸酶可以解除植酸抗營養(yǎng)作用，提高動物飼料的營養(yǎng)價值，改善動物的生產(chǎn)性能，同時減少動物糞便中植酸磷的含量，降低磷對環(huán)境的污染程度，因此植酸酶對提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益及環(huán)保效益具有十分重要的意義。

畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母，可利用甲醇作為唯一碳源生產(chǎn)植酸酶。甲醇代謝的第一步是醇氧化酶利用氧分子將甲醇氧化為甲醛，生成過氧化氫。編碼醇氧化酶的兩種基因分別是aox1和aox2，aox1轉(zhuǎn)錄水平遠高于aox2。在甲醇條件下能夠大量表達aox1，其生成的mRNA占總mRNA的5%，翻譯生成的蛋白占總可溶性蛋白比例30%[1]。通過對兩種醇氧化酶基因aox1和aox2的改造，目前畢赤酵母有三種表型，分別是Mut+、Muts、Mut-[2-3]。1985年，Ellis等[4]首次從畢赤酵母菌中分離出醇氧化酶aox1基因及其啟動子PAOX1。Cregg等[5]用強啟動子PAOX1，利用畢赤酵母來生產(chǎn)重組蛋白。畢赤酵母表達重組蛋白中菌株改造、構(gòu)建表達載體、分子操作手冊的制定都進一步推動畢赤酵母表達系統(tǒng)的廣泛應用[5-6]。

畢赤酵母GS115菌株含有aox1基因，這種菌株能快速利用甲醇作為碳源和能源，能在甲醇培養(yǎng)基中以野生型速率生長，因此稱為甲醇利用快型菌株(Mut+)。GS115菌株同時含有aox2基因，aox2基因與aox1基因同源性92%，其編碼的蛋白與aox1基因編碼的蛋白有97%同源性，能緩慢利用甲醇。

在實際發(fā)酵生產(chǎn)中，甲醇的成本超過整個發(fā)酵成本的50%，如果能夠降低甲醇用量，則可以降低發(fā)酵成本。本研究以畢赤酵母appaT菌株為出發(fā)菌株，通過同源重組的方法敲除aox1基因，試圖改變菌體利用甲醇的速度，從而減少甲醇用量，預期將降低發(fā)酵成本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

appaT菌株，是一株畢赤酵母菌株，作為出發(fā)菌株，本研究室保存；質(zhì)粒pUG6（包含KanMX基因表達盒）、pUC19質(zhì)粒（用于構(gòu)建重組質(zhì)粒），均由天津科技大學郭學武老師贈送。

1.1.2 主要試劑和工具酶

PCR引物由鼎國生物技術(shù)有限公司合成；DNA測序分析由華大基因完成。DNA聚合rTaq、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶購自大連寶生物公司。

1.2 基因組提取和PCR方法

DNA提取、凝膠電泳、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等均使用標準技術(shù)，參考Joseph等[7]文獻進行操作。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 LB培養(yǎng)基

蛋白胨1%、氯化鈉1%、酵母粉0.5%，pH 7.0。

1.3.2 YPD培養(yǎng)基

葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母粉1%，pH 6.0。

1.3.3 一級、二級種子罐、發(fā)酵罐培養(yǎng)基

甘油30 g/L、磷酸二氫銨30 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鉀10 g/L、硫酸鎂5 g/L、硫酸鈣0.5 g/L、氫氧化鉀0.5 g/L、PTM1 4.37 g/L。

1.4 培養(yǎng)方法

將搖瓶菌液以0.5%接種量接種一級種子罐，通氣量40 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，培養(yǎng)過程中pH維持在5.0，培養(yǎng)周期25 h。將一級種子液以10%接種量接種二級種子罐，通氣量400 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)過程中pH維持在5.0。培養(yǎng)周期8 h，種子成熟后全部移種發(fā)酵罐。發(fā)酵過程中用氨水將pH維持在4.5，培養(yǎng)溫度29℃，當甘油耗盡后，流加質(zhì)量分數(shù)為50%的甘油，流加速率為15 mL/（L/h），將菌體濕重維持在220 g/L，然后開始甲醇誘導，甲醇流速控制在2.5 mL/（L/h）。整個發(fā)酵過程中通氣比維持在1∶1，攪拌轉(zhuǎn)速為130 r/min。

1.5 發(fā)酵罐能耗成本計算方法

單罐能耗成本（元）=單罐攪拌耗電量×單價+壓縮空氣流量×單價+冰機耗電量×單價+蒸汽用量×單價。單罐能耗節(jié)約成本（元）=工藝改進前單罐能耗成本-工藝改進后單罐能耗成本。

1.6 植酸酶活性的測定

按照GB/T 18634—2009《飼用植酸酶活性的測定分光光度法》進行酶活性的測定。在溫度37℃、pH 5.50條件下，每分鐘從濃度為5.0 mmol/L植酸鈉溶液中釋放1μmoL無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010初步整理后，利用SPSS 18.0軟件進行獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的獲得（見圖1～圖3）

圖1 pUC19質(zhì)粒和AA片段

圖2 KanMX基因PCR產(chǎn)物

圖3 BB片段PCR產(chǎn)物

在NCBI上查到Komagataella phaffiiGS115，Al?cohol oxidase基因序列。根據(jù)aox1基因及上下游基因序列，設(shè)計兩對引物，一對為AA-U和AA-D，另一對為BB-U和BB-D。以appaT基因組為模板，利用引物AA-U和AA-D擴增AA片段（即aox1基因啟動子的一部分，作為同源重組片段的上游同源臂），AA片段403 bp，利用引物BB-U和BB-D擴增BB片段（即aox1基因自身的一部分片段，作為同源重組片段的下游同源臂），BB片331 bp。以質(zhì)粒pUG6為模板，利用引物K-U和K-D擴增1 613 bpKanMX基因片段。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證（見圖4、圖5）

圖4 重組質(zhì)粒pUC-AKB的構(gòu)建

圖5 重組質(zhì)粒的酶切驗證

將pUC19質(zhì)粒（2 686 bp）和AA片段分別用HindⅢ和BamH I雙酶切后，用DNA連接酶進行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。提取大腸桿菌中的質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行HindⅢ和BamH I雙酶切驗證，得到片段大小分別是2 686 bp和403 bp，證明重組質(zhì)粒pUC-A構(gòu)建成功。

表1 PCR引物

將BB片段與pUC-A質(zhì)粒分別用KpnI和EcoR I雙酶切，用DNA連接酶進行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。提取大腸桿菌中的質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行KpnI和EcoR I雙酶切驗證，得到片段大小分別為3 089 bp和331 bp，證明重組質(zhì)粒pUC-AB構(gòu)建成功。

將KanMX片段與pUC-AB質(zhì)粒分別用BamH I和KpnI雙酶切，用DNA連接酶進行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。提取大腸桿菌中的質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行BamH I和KpnI雙酶切驗證，得到片段大小分別為3 420 bp和1 613 bp，證明重組質(zhì)粒pUCAKB構(gòu)建成功。

2.3 重組片段的獲得（見圖6）

圖6 PCR擴增AA-KanMX-BB片段

以重組質(zhì)粒pUC-AKB為模板，以AA-U和BB-D為引物擴增得AA-KanMX-BB片段，片段大小為2 347 bp。

2.4 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化

在80μL酵母感受態(tài)細胞中加入待轉(zhuǎn)化片段1～5μg，冰上放置15 min。迅速加入0.2 cm電擊杯中，電擊參數(shù)1 500 V、200Ω、25μF，迅速加入900μL山梨醇，30℃靜置培養(yǎng)1 h，涂平板（含G418終濃度1 mg/mL）。

2.5 重組菌株的構(gòu)建（見圖7、圖8）

將重組片段通過電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入酵母菌株中，通過G418抗性（具有KanMX的酵母菌株表現(xiàn)為一定濃度的G418抗性）進行篩選，再以?上游（KanMX基因的675 bp處）和?下游（染色體上aox1基因下游744 bp處）為引物進行PCR篩選驗證，擴增大小為2 206 bp的片段。同時用appaT菌株基因組做對照。如圖7所示，以?上游和?下游為引物，appaT菌株基因組為模板，沒有PCR產(chǎn)物；重組菌株?2因發(fā)生了同源重組，以?上游和?下游為引物能擴增出2 206 bp條帶。同時用a-因子引物/3'AOX引物，如果PCR產(chǎn)物大小為1.4 kb左右（如圖8所示）說明植酸酶基因在基因組上，沒有被替換掉。證明重組菌株?2構(gòu)建正確。

圖7 以?上游和?下游引物篩選驗證重組菌株

圖8 以a-因子引物/3'AOX引物驗證重組菌株的植酸酶基因

2.6 重組菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果

將得到的重組菌株?2與出發(fā)菌株appaT在G418平板中三區(qū)劃線，挑取平板上的單菌落，接種到30 mL YPD培養(yǎng)基中，進行種子活化。取500μL種子液，接種50 mL BMGY種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)20 h，將培養(yǎng)液離心，棄上清，將菌體轉(zhuǎn)接到25 mL BMMY發(fā)酵培養(yǎng)基中（含0.5%甲醇），每間隔24 h，向培養(yǎng)基中加入0.5%的甲醇，培養(yǎng)68 h。每株菌接種5個平行搖瓶，數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”表示。發(fā)酵結(jié)果見表2。

從表2可以看出，重組菌株?2與appaT菌株生產(chǎn)植酸酶的性能并不相同，差異顯著。appaT菌株發(fā)酵68 h，酶活為557 U/mL，此時?2菌株酶活為621 U/mL，是appaT酶活的1.11倍?？紤]菌體濕重對酶活的影響，計算可得?2菌株比酶活是appaT菌株的1.38倍。說明?2菌株有較好的發(fā)酵性能。

表2 重組菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果

2.7 重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)

重組菌株的發(fā)酵過程中用氨水將pH維持在4.5，培養(yǎng)溫度29℃，當甘油耗盡后，流加質(zhì)量分數(shù)為50%的甘油，流加速率為15 mL/（L/h），將菌體濕重維持在220 g/L，然后開始甲醇誘導，甲醇流速控制在2.5 mL/（L/h）。整個發(fā)酵過程中通氣比維持在1∶1，攪拌轉(zhuǎn)速為130 r/mim。誘導160 h，放罐酶活在21 500 U/mL，放罐菌體濕重在320 g/L，整個發(fā)酵過程中甲醇用量約為18 t。10批次發(fā)酵罐數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表3 重組菌株單罐發(fā)酵能耗成本

重組菌株?2發(fā)酵能力同原菌株appaT接近，但生產(chǎn)能耗大幅降低。由表3可知，重組菌株單罐能耗總成本為46 790元，原生產(chǎn)菌株的單罐能耗總成本為78 427元，單罐能耗成本降低31 637元。甲醇用量降低10 t，按照3 000元/t計算，成本降低約3萬元，單罐發(fā)酵成本降低約6.16萬元。

3 討論

目前國內(nèi)外主要利用畢赤酵母作為植酸酶基因高效表達的宿主細胞，高密度發(fā)酵工藝已成為生物技術(shù)中進行中試生產(chǎn)的主要發(fā)酵工藝[8]。在不影響植酸酶表達量的前提下，為了降低發(fā)酵成本，通常會采用廉價的發(fā)酵培養(yǎng)基。Tang等[9]以畢赤酵母基因工程菌為生產(chǎn)菌株，研究了以生物柴油生產(chǎn)中的廢棄甘油為碳源生產(chǎn)植酸酶的發(fā)酵工藝。Bai等[10]研究了利用谷氨酸生產(chǎn)廢水作為培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母基因工程菌生產(chǎn)植酸酶的工藝。

國內(nèi)外學者目前在畢赤酵母利用甲醇生產(chǎn)重組蛋白的基因工程改造方面的研究多集中在對醇氧化酶啟動子的改造，而對植酸酶生產(chǎn)菌株的醇氧化酶基因敲除方面的報道較少。王旗[11]對畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子編碼基因MIT1和PRM1，以及碳源阻遏因子編碼基因MIG1、MIG2和NRG1與AOX1啟動子之間的相互作用進行研究。王小龍[12]通過對PAOX1調(diào)控網(wǎng)絡的代謝工程改造，得到兩個能夠以甘油為碳源誘導PAOX1表達的非甲醇畢赤酵母表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)有望用于工業(yè)上生產(chǎn)外源蛋白。沈偉[13]對畢赤酵母進行激酶基因系統(tǒng)性研究，有助于探討畢赤酵母PAOX1調(diào)控機制。高嬌[14]利用Cre/lox重組酶系統(tǒng)，通過構(gòu)建不同的敲除表達盒，在一株畢赤酵母菌中連續(xù)敲除AOX1、AOX2等基因，得到5株重組菌株。將重組菌株在甘油和甲醇混合的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，其中?AOX1/2-WT菌株在發(fā)酵工程中增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的表達水平最好，較WT菌株提高了53.6%。

在畢赤酵母appaT的誘導表達階段，甲醇是誘導劑。在實際發(fā)酵生產(chǎn)中，甲醇的成本超過整個發(fā)酵成本的50%，如果能夠降低甲醇用量，則可以降低發(fā)酵成本。出發(fā)菌株appaT同時含有aox1基因和aox2基因，兩個基因同源性92%，aox2基因編碼的蛋白與aox1基因編碼的蛋白有97%同源性，能緩慢利用甲醇。在甲醇存在下，菌株需要消耗大量的能量來代謝甲醇，醇氧化酶作為甲醇代謝途徑上第一個關(guān)鍵酶，對菌體代謝甲醇非常重要。以appaT菌株為出發(fā)菌株，通過同源重組的方法敲除aox1基因，改變菌體利用甲醇的速度，從而減少甲醇用量，達到降低發(fā)酵成本的目的。出發(fā)菌株在甲醇代謝過程需要消耗大量的氧氣，通過提高攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量仍無法滿足耗氧需求，同時氧氣的消耗也會產(chǎn)生大量的熱量，最終增加了高供氧和制冷的成本。與出發(fā)菌株相比，敲除aox1基因的?2菌株的菌體濕重有所降低，菌體產(chǎn)熱降低，因此減少了冰機的耗能；?2菌株通氣比較低，節(jié)約了空壓機用氣量；攪拌轉(zhuǎn)速較低，節(jié)約了攪拌耗電量。因此，敲除aox1基因的?2菌株從能耗方面降低了發(fā)酵成本。

研究通過同源重組的方法，敲除畢赤酵母菌的醇氧化酶aox1基因，得到的重組菌株?2發(fā)酵能力同原菌株appaT接近，生產(chǎn)能耗大幅降低，同時降低了甲醇用量，從能耗和原料兩方面都降低了發(fā)酵成本。因此，本研究的重組菌株具有創(chuàng)新性和先進性，在植酸酶工業(yè)化生產(chǎn)方面具有明顯優(yōu)勢。

4 結(jié)論

以畢赤酵母appaT菌株為出發(fā)菌株，通過同源重組的方法敲除aox1基因，改變菌株利用甲醇的速度，降低甲醇用量，降低發(fā)酵成本。在實際發(fā)酵生產(chǎn)中，aox1基因缺失的菌株發(fā)酵能力與原有菌株接近，但生產(chǎn)能耗大幅降低，甲醇用量降低，最終單罐發(fā)酵成本降低約20%～24%。