■劉夢倩 文露婷， 李 旻 趙 怡 杜雪松 覃俊奇 胡庭俊 林 勇*

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021）

吉富羅非魚（Oreochromis niloticus,GIFT strain）是尼羅羅非魚經(jīng)遺傳改良而選育得到的羅非魚新品系，因其生長速度快、個體大、出肉率高和易捕撈等優(yōu)點(diǎn)成為了我國羅非魚（Tilapia）養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種[1-4]。但隨著羅非魚的大規(guī)模高密度養(yǎng)殖和抗生素類藥物在水產(chǎn)飼料添加劑中的禁用，羅非魚鏈球菌等細(xì)菌病、肝膽綜合征等代謝性疾病的頻繁暴發(fā)給養(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。因此開發(fā)一種安全高效，且能夠增加魚體自身免疫能力的飼料添加劑成為了近年來的研究熱點(diǎn)[6-7]。中藥活性成分提取物因具有安全、有效、低毒等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在飼料添加劑中[8-9]。山豆根（Sophora tonki?nensis），又名廣山豆根，是豆科槐屬植物越南槐的干燥根及根莖，是一種具有抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等藥理活性的廣西道地中藥材[10-11]。山豆根多糖（Sopho?ra subprostratepolysaccharide,SSP）是從山豆根中提取、分離、純化得到的總多糖[12-13]。相比于山豆根生物堿而言，山豆根多糖在動物機(jī)體上的使用更加安全且同時兼?zhèn)涿庖哒{(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒等藥理活性[14-16]。帥學(xué)宏等[17]將不同濃度的山豆根多糖（SSP）注射到免疫抑制模型小鼠腹腔后，發(fā)現(xiàn)SSP通過提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和還原型谷胱甘肽（GSH）水平，增加小鼠胸腺清除羥自由基的能力，說明SSP通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)自由基相關(guān)酶的活性來影響體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除能力，從而使機(jī)體免疫器官免受氧化損傷，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。本實(shí)驗室前期開展了山豆根多糖不同添加量對羅非魚的生長性能、免疫與抗菌性能等影響的研究，得出2 g/kg的山豆根多糖添加量對羅非魚具有較為理想的促生長和提高免疫力的效果。結(jié)合前期研究的初步結(jié)果，現(xiàn)擴(kuò)大羅非魚的試驗樣本量，以2 g/kg的山豆根多糖為最佳的推薦劑量對羅非魚進(jìn)行為期30 d的養(yǎng)殖投喂試驗，通過測定羅非魚生長性能及免疫相關(guān)指標(biāo)，探討2 g/kg的山豆根多糖作為飼料添加劑在羅非魚養(yǎng)殖實(shí)踐中的應(yīng)用效果，為開發(fā)新型飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

山豆根多糖，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗室分離提取，為白色粉末，易溶于水，在乙醇中幾乎不溶；與堿性酒石酸銅反應(yīng)呈棕紅色沉淀；單糖含量為9.36%；干燥失重為3.25%；重金屬<10 mg/kg；蛋白質(zhì)檢測未見渾濁；多糖含量為83.58%；黃芪多糖（APS），購于艾迪森（北京）生物科技有限公司；基礎(chǔ)飼料為羅非魚膨化配合飼料，購于通威股份有限公司（營養(yǎng)成分：粗蛋白≥28.0%、粗脂肪≥3.0%、粗纖維≤10.0%、粗灰分≤13%、賴氨酸≥1.3%、鈣0.5%～2.5%、總磷0.6%～2.0%、氯化鈉0.3%～1.5%、水分≤12.0%）。按投料量0.2%的質(zhì)量百分比（即2 g/kg）稱取山豆根多糖，按20 mg/kg稱取相應(yīng)的黃芪多糖，用滅菌ddH2O分別溶解后均勻噴灑于各試驗組飼料表面，輔以水產(chǎn)飼料黏合劑（主要成分為淀粉）混勻，39℃烘干；一氧化氮（NO）、總抗氧化能力（T-AOC）和多種酶活性檢測試劑盒均購于南京建成生物工程技術(shù)研究所；免疫球蛋白（IgG）、白細(xì)胞介素12（IL-12）和γ-干擾素（IFN-γ）檢測試劑盒均購自將來實(shí)業(yè)（上海）股份有限公司。

1.2 試驗動物

910尾處于快速生長期吉富品系羅非魚由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究院國家級羅非魚良種場提供，體質(zhì)健壯，體重為（58.00±1.69）g。采用3%食鹽水對良種基地引進(jìn)的羅非魚進(jìn)行體表浸泡消毒，暫養(yǎng)于廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院水族實(shí)驗樓30 m3的長方體露天魚池內(nèi)，馴養(yǎng)7 d后隨機(jī)抽取10尾魚，剖取魚腦組織和肝臟組織進(jìn)行病菌分離培養(yǎng)，經(jīng)檢查無病菌生長后開始試驗。

1.3 主要儀器

ESJ110-4B分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）、TD5A-WS臺式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司）、H1650-W臺式微量高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司）、Sysemx2100全自動血液分析儀（日本SYSMEX公司）、Hltachi7180全自動生化分析儀（日本日立診斷產(chǎn)品有限公司）、Rayto RT-6100全自動酶標(biāo)儀（美國雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.4 動物分組及處理

將900尾吉富羅非魚隨機(jī)分為3個試驗組，分別為山豆根多糖組（飼料中添加2 g/kg的山豆根多糖）、黃芪多糖對照組（飼料中添加20 mg/kg的黃芪多糖）以及空白對照組（投喂基礎(chǔ)飼料），每組3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)100尾羅非魚，分別飼養(yǎng)于30 m3方形魚池的9個不同的網(wǎng)箱內(nèi)。每天按魚體重的5%，分3次（9：00、12：00、18：00）進(jìn)行投料，飼養(yǎng)周期為30 d。試驗期間連續(xù)供氧，每天上午喂料前換水2/3，試驗期間水溫（27±2）℃，每天觀察池內(nèi)羅非魚的活動情況。

1.5 樣品采集和相關(guān)指標(biāo)檢測

1.5.1 生長性能指標(biāo)

于試驗開始前1 d和給藥后第30 d，對羅非魚停飼12 h，從每個試驗組的重復(fù)池中隨機(jī)抓取羅非魚各30尾，經(jīng)適量MS-222麻醉后，用電子天平對其進(jìn)行體重測量（分度值為0.01 g），再經(jīng)尾靜脈竇采集血液，最后剖取其完整的脾臟稱重并記錄，另剖其肝臟取同一部位約1 g樣品存于-80℃，用于后續(xù)相關(guān)酶活性的測定。按以下標(biāo)準(zhǔn)公式計算相關(guān)生長性能。

增重率（WGR，%）=[末重(g)-初重(g)]/初重(g)×100

特定生長率（SGR，%/d）=[ln末重(g)-ln初重(g)]/飼養(yǎng)時間(d)×100

肥滿度（CF，g/cm3）=體重(g)/[體長(cm)]3×100

飼料系數(shù)（FCR）=飼料攝入量（g）/[末重(g)-初重(g)]脾臟指數(shù)（SI，%）=脾重(g)/體重(g)×100

1.5.2 血液生理、生化、抗氧化及免疫指標(biāo)測定

將上述給藥后第30 d進(jìn)行生長性能測定的羅非魚進(jìn)行血液采集，將得到的血液樣本分為兩份分別進(jìn)行生理和生化指標(biāo)的測定。用2 mL一次性無菌注射器從羅非魚的臀鰭側(cè)線下方進(jìn)針，抽取尾靜脈血2～3 mL，每一尾魚的血液作為一個樣本分為兩份：一份加入到含ETDA-K2的抗凝采血管中，4 h以內(nèi)進(jìn)行全血常規(guī)生理指標(biāo)測定；剩余血液裝于2 mL無菌EP管內(nèi)，斜置，4℃冰箱內(nèi)靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，分裝血清，用于血液生化指標(biāo)以及酸性磷酸酶（ACP）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、免疫球蛋白（IgG）、白細(xì)胞介素12（IL-12）等血清抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的測定。

1.5.3 肝臟抗氧化指標(biāo)測定

將采集的肝臟組織用滅菌生理鹽水進(jìn)行勻漿，在3 000 r/min下離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行肝臟總蛋白濃度、過氧化物酶（POD）、總抗氧化能力（T-AOC）等抗氧化指標(biāo)的測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics V26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山豆根多糖對羅非魚生長性能的影響（見表1）

從表1可知，在初始體重一致（P>0.05）的情況下，山豆根多糖組和黃芪多糖對照組的羅非魚終末體重顯著高于空白對照組（P<0.05），并且增重率（WGR）和特定生長率（SGR）均極顯著高于空白對照組（P<0.01）；3個試驗組羅非魚肥滿度（CF）和飼料系數(shù)（FCR）均無顯著差異（P>0.05）；黃芪多糖對照組羅非魚的脾臟指數(shù)極顯著高于山豆根多糖組和空白對照組（P<0.01）。

2.2 山豆根多糖對羅非魚血液生理指標(biāo)的影響（見表2）

表2 山豆根多糖對羅非魚血液生理指標(biāo)的影響（n=30）

如表2所示，山豆根多糖組和黃芪多糖對照組羅非魚血液中淋巴細(xì)胞比例均極顯著高于空白對照組（P<0.01）；與空白對照組和黃芪多糖對照組相比，山豆根多糖極顯著降低了羅非魚血液中中性粒細(xì)胞百分比和血紅蛋白濃度（P<0.01）；其余各項血液生理指標(biāo)差異不顯著（P>0.05）。

2.3 山豆根多糖對羅非魚血液生化指標(biāo)的影響（見表3）

表3 山豆根多糖對羅非魚血液生化指標(biāo)的影響（n=30）

從表3可見，與黃芪多糖對照組和空白對照組相比，山豆根多糖組顯著降低了羅非魚血清中白蛋白和堿性磷酸酶的水平（P<0.05）；山豆根多糖組羅非魚血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著高于空白對照組（P<0.01），且顯著低于黃芪多糖對照組（P<0.05）；山豆根多糖組羅非魚血清中三酰甘油含量與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05），與黃芪多糖對照組相比極顯著升高（P<0.01）；各試驗組羅非魚血清中總蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性和肌酐含量差異均不顯著（P>0.05）。

2.4 山豆根多糖對羅非魚血清免疫指標(biāo)的影響（見表4）

表4 山豆根多糖對羅非魚血清免疫指標(biāo)的影響（n=30）

從表4可見，黃芪多糖對照組羅非魚血清中酸性磷酸酶（ACP）極顯著低于山豆根多糖組（P<0.01），但與空白對照組差異不顯著（P>0.05）；黃芪多糖對照組羅非魚血清一氧化氮（NO）水平極顯著高于山豆根多糖組（P<0.01），但兩者與空白對照組差異不顯著（P>0.05）；黃芪多糖對照組羅非魚血清溶菌酶（LZM）水平顯著高于山豆根多糖組（P<0.05），且極顯著高于空白對照組（P<0.01）。山豆根多糖組和黃芪多糖對照組羅非魚血清中過氧化物酶（POD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平均極顯著高于空白對照組（P<0.01）；山豆根多糖血清中總抗氧化能力（T-AOC）極顯著低于黃芪多糖對照組和空白對照組（P<0.01）；山豆根多糖組和黃芪多糖對照組羅非魚血清中總超氧化物歧化酶（T-SOD）水平均極顯著低于空白對照組（P<0.01）。各試驗組羅非魚血清中多酚氧化酶（PPO）活性均差異不顯著（P>0.05）。

2.5 山豆根多糖對羅非魚血清中細(xì)胞因子分泌的影響（見圖1）

從圖1可知，與空白對照相比，山豆根多糖極顯著提高了羅非魚血清中IFN-γ水平（P<0.01），并且極顯著降低羅非魚IL-12和IL-2水平（P<0.01）；黃芪多糖對照組羅非魚血清中IFN-γ水平也極顯著高于空白對照組。

圖1 山豆根多糖對羅非魚血清中細(xì)胞因子分泌的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=30）

2.6 山豆根多糖對羅非魚肝臟免疫功能的影響（見表5）

表5 山豆根多糖對羅非魚肝臟免疫指標(biāo)的影響（n=30）

從表5可見，山豆根多糖組與黃芪多糖對照組均能提高羅非魚的肝臟中過氧化物酶（POD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，與空白對照相比差異極顯著（P<0.01），其中山豆根多糖組POD活性顯著低于黃芪多糖對照組（P<0.05），而山豆根多糖組GSH-Px水平顯著高于黃芪多糖對照組（P<0.05）；黃芪多糖組提高了羅非魚肝臟中總抗氧化能力（T-AOC），與山豆根多糖組和空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；山豆根多糖組總超氧化物歧化酶（T-SOD）顯著低于黃芪多糖對照組和空白對照組（P<0.05）。

3 討論

3.1 山豆根多糖對羅非魚生長性能的影響

研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加黃芪多糖能顯著提高卵形鯧鲹和尼羅羅非魚的增重率和特定生長率，其促生長的效果隨飼料中黃芪多糖含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢[18-19]。在本試驗中，向羅非魚飼料中分別添加2 g/kg的山豆根多糖和20 mg/kg的黃芪多糖并連續(xù)投喂30 d后，羅非魚的增重率、特定生長率都極顯著高于空白對照組，而各試驗組魚的飼料系數(shù)并無顯著差異。表明山豆根多糖和黃芪多糖一樣具有促進(jìn)羅非魚生長并提高飼料轉(zhuǎn)化率、降低養(yǎng)殖成本的積極作用。許丹寧等[20]在研究白術(shù)多糖促仔豬生長的內(nèi)分泌機(jī)制時發(fā)現(xiàn)：白術(shù)多糖可能是通過促進(jìn)下丘腦-垂體-肝臟生長軸上血清生長激素（GH）、類胰島素生長因子-1（IGF-I）的合成與分泌，提高蛋白合成，增強(qiáng)肌肉生長，同時促進(jìn)T3、T4和cAMP的合成與分泌，加速脂肪的氧化分解。而本試驗中山豆根多糖促生長的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

3.2 山豆根多糖對羅非魚血液生理生化指標(biāo)的影響

血清中生化物質(zhì)的相對含量反映了機(jī)體生理及營養(yǎng)狀態(tài)[21]。黃芪多糖能降低羅非魚的三酰甘油含量，證實(shí)了黃芪多糖具有降血脂的作用。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶在機(jī)體的蛋白代謝中發(fā)揮著重要的作用，兩者在體內(nèi)的活性是反映肝功能的重要指標(biāo)，兩者在血清中含量上升提示肝細(xì)胞受損，而下降則標(biāo)志著疾病的康復(fù)[22]。在本試驗中，山豆根多糖和黃芪多糖對照組羅非魚血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性均明顯提高，而山豆根多糖組羅非魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性又低于黃芪多糖對照組。并且山豆根多糖組羅非魚血清中白蛋白和堿性磷酸酶顯著低于黃芪多糖組。表明兩者添加到飼料中長期投喂可能對羅非魚肝臟有一定的損傷，其具體的臟器損傷程度有待做下一步病理學(xué)分析。這一結(jié)果與譚連杰[18]和孫愛杰等[23]在研究當(dāng)歸多糖、枸杞多糖和黃芪多糖對卵形鯧鲹血液生化指標(biāo)的結(jié)果一致，體現(xiàn)了單純的植物多糖在生物活性調(diào)節(jié)作用上的雙向性。

3.3 山豆根多糖對羅非魚免疫功能的影響

免疫細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是動物機(jī)體的淋巴器官產(chǎn)生的一類白細(xì)胞，作為魚類體內(nèi)含量最多的白細(xì)胞，魚類的淋巴細(xì)胞參與了機(jī)體自身的特異性免疫反應(yīng)，在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，淋巴細(xì)胞在血液中的相對含量和活性可以反映出機(jī)體的免疫水平[24]。研究表明，香菇多糖、靈芝多糖、枸杞多糖等均可有效提高魚類的免疫細(xì)胞活性[25]。與上述研究結(jié)果相似，本試驗中山豆根多糖組和黃芪多糖對照組均能顯著促進(jìn)羅非魚血液中淋巴細(xì)胞的增殖，提高羅非魚血液中淋巴細(xì)胞的比率，進(jìn)而增強(qiáng)羅非魚的免疫力。

在本試驗中黃芪多糖的抗氧化活性是通過降低羅非魚血清中酸性磷酸酶活性并且同時提高溶菌酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化能力活性來實(shí)現(xiàn)的。而山豆根多糖則通過提高羅非魚血清和肝臟中過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，同時降低血清和肝臟的總抗氧化能力和總超氧化物歧化酶的活性來增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，以此確保體內(nèi)氧化和抗氧化反應(yīng)的動態(tài)平衡。

4 結(jié)論

2 g/kg的山豆根多糖添加量能有效促進(jìn)池養(yǎng)羅非魚的生長，增加飼料轉(zhuǎn)化率，節(jié)約成本，并通過增加淋巴細(xì)胞比例，提高過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性來增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。