藍(lán)娜娜，張薷月，蘇然，楊倩, 張建國(guó)

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，食品科學(xué)與工程研究所，上海，200093)

木聚糖酶是一種廣泛用于食品、飼料、造紙工業(yè)的酶。它的作用為降解木聚糖產(chǎn)生更小分子的木聚糖，甚至單分子木糖[1]。微生物來(lái)源的木聚糖酶約占總木聚糖來(lái)源種類(lèi)的80%。為了生產(chǎn)更多的木聚糖酶，木聚糖酶基因在細(xì)菌、酵母、真菌和植物中都得到成功表達(dá)[2-3]。畢赤酵母(Komagataellaphaffii)是一種較為理想的外源蛋白表達(dá)宿主[4]，它以甲醇為唯一碳源而生長(zhǎng)。甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶啟動(dòng)子AOX1能大量表達(dá)醇氧化酶。畢赤酵母作為真核表達(dá)宿主的優(yōu)點(diǎn)可以總結(jié)如下：(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一；(2)表達(dá)效率高,其表達(dá)的外源蛋白可占總表達(dá)蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分離純化；(3)類(lèi)似于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，酵母的生長(zhǎng)是快速和便宜的，而且酵母細(xì)胞是真核生物，因此它們具有翻譯后修飾的機(jī)制；(4)表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合；(5)由于該酵母可以以甲醇為唯一碳源和能源,而絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源,可以減少污染。所以畢赤酵母的AOX1表達(dá)系統(tǒng)被廣泛用來(lái)表達(dá)外源蛋白[5]。多年來(lái)，畢赤酵母已被學(xué)術(shù)界和工業(yè)界證明能表達(dá)各種外源蛋白[6]，由于畢赤酵母來(lái)源的外源蛋白的安全性較好，目前已經(jīng)有多種畢赤酵母表達(dá)的外源蛋白被批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)[7]。目前畢赤酵母利用AOX1啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白的誘導(dǎo)物仍采用甲醇。為了避免殘留甘油對(duì)AOX1啟動(dòng)子的抑制，誘導(dǎo)過(guò)程中需要將培養(yǎng)基從甘油培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)榧状寂囵B(yǎng)基，所以畢赤酵母的外源蛋白誘導(dǎo)步驟仍然較繁瑣。另外，由于工業(yè)上使用甲醇的危險(xiǎn)性和毒性，很多學(xué)者擬通過(guò)改造AOX1啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)非甲醇誘導(dǎo)物誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)外源蛋白[8]。發(fā)現(xiàn)其他非甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也是目前的一個(gè)選擇。目前報(bào)道的非甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子有甘油誘導(dǎo)的3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(PGAP)[9]、鳥(niǎo)苷三磷酸酶分泌相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子(PYPT1)[10]、二強(qiáng)丙酮合成酶啟動(dòng)子(PDHAS)[11]、甲醛脫氫酶啟動(dòng)子(FLD1)[12]、乙醇誘導(dǎo)的異檸檬酸裂解酶啟動(dòng)子(PICL1)[13]、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子1-α啟動(dòng)子(PTEF1)[14]、3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(PPGK1)[15]。但是這些非甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度都沒(méi)有達(dá)到AOX1的表達(dá)強(qiáng)度，造成外源蛋白表達(dá)量不高。所以AOX1啟動(dòng)子仍是畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的主要啟動(dòng)子。本研究的非甲醇誘導(dǎo)劑從甲基類(lèi)水溶性無(wú)機(jī)物考慮，以甲酸銨誘導(dǎo)畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白，探討非甲醇誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白的途徑。

1　材料和方法

1.1　菌株和試劑

表達(dá)木聚糖酶的重組畢赤酵母菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。酵母粉和蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。木聚糖購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。其他化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

精密恒溫培養(yǎng)箱(BPH-G082型)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；單人凈化工作臺(tái)(SW-CJ-1D型)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌(LDZX-50KBS型)，上海申安醫(yī)療器械廠；電子天平(PL2002型)，梅特勒-托利多儀器有限公司；pH計(jì)(PB-10型)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)(722S)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；低速大容量多管離心機(jī)(飛鴿LXJ-IIB)，上海安亭科學(xué)儀器廠；、小型高速離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀,美谷分子儀器有限公司。

1.2　培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基：酵母粉10.0 g、蛋白胨20.0 g、葡萄糖20.0 g(固體另加瓊脂粉20.0 g)，加水定容至1.0 L,115 ℃滅菌20 min。

BMGY培養(yǎng)基：溶解10.0 g酵母粉、20.0 g蛋白胨于700 mL水中，高壓滅菌20 min，冷至室溫，加入下列混合液：100 mL 1.0 mol/L PBS緩沖液pH 6.0、100mL 13.4%YNB、100 mL 10%甘油、2 mL 4×10-4g/L生物素,加水定容至1.0 L。

BMMY培養(yǎng)基：溶解10.0 g酵母粉、20.0 g蛋白胨于700 mL水中，高壓滅菌20 min，冷至室溫，加入下列混合液：100 mL 1.0 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0，100 mL 13.4%YNB，100 mL 5 %甲醇，2 mL 4×10-4g/L生物素,加水定容至1.0 L。

3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液：取3,5-二硝基水楊酸3.15 g于250 mL水中，45 ℃溶解后加入NaOH 10.48 g，不停攪拌后加入酒石酸鉀鈉92.5 g，溶解后加入苯酚2.5 g，溶解后加入Na2SO42.5 g，攪拌待全部溶解后定容至500 mL。

PBS緩沖液：稱(chēng)取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.63g, KH2PO40.24g，溶于900 mL雙蒸水中，用HCl調(diào)pH值至6.0，加水定容至1.0 L，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3　甲醇誘導(dǎo)重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶的條件優(yōu)化

將重組畢赤酵母轉(zhuǎn)接至5 mL YPD,在30 ℃、200 r/min條件下活化至OD600達(dá)到1.3～1.5之間，按4%接種量接入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，24 h后離心，沉淀轉(zhuǎn)入100 mL BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。本研究中優(yōu)化了甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中的溫度、pH、甲醇添加量3個(gè)條件。在沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下默認(rèn)條件為30 ℃，1%甲醇添加量,pH 6.0。其中設(shè)置溫度為26、28、30、32 ℃，pH設(shè)置為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，甲醇添加量的梯度設(shè)置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。

1.4　甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶

重組畢赤酵母的培養(yǎng)過(guò)程為將重組畢赤酵母轉(zhuǎn)接至5 mL YPD，在30 ℃、200 r/min條件下活化至OD600達(dá)到1.3～1.5之間，按4%接種量接入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，24 h后離心，沉淀轉(zhuǎn)入100 mL BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，然后每天添加1.0%甲醇不同量的山梨醇。山梨醇的添加量設(shè)置為0.02%、0.05%、0.08%、0.11%、0.14%。

1.5　甲酸銨誘導(dǎo)重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶

重組畢赤酵母的培養(yǎng)過(guò)程為將重組畢赤酵母轉(zhuǎn)接至5 mL YPD，在30 ℃、200 r/min條件下活化至OD600達(dá)到1.3～1.5之間，按4%接種量接入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，24 h后離心，沉淀轉(zhuǎn)入100 mL BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。甲酸銨單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)甲酸銨添加量梯度設(shè)置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、5.0%。在甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)，采用最優(yōu)甲酸銨添加條件下，同時(shí)添加山梨醇(0.1%、0.5%、1%)。在甲醇和甲酸銨聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)采用每天添加1.0%甲醇和甲酸銨(0.5%、1%、1.5%、2.0%、5.0%)。

1.6　細(xì)胞濃度的測(cè)定

將細(xì)胞樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后在600 nm下測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞濃度。

1.7　木聚糖酶活力的測(cè)定

以4 ℃、12 000g離心發(fā)酵液10 min上清即粗酶液。取20 μL粗酶液加入到1 mL含有10 g/L木聚糖的pH 5.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中。50 ℃保溫5 min后加入2 mL DNS溶液煮沸10 min，然后冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀在540 nm測(cè)定吸光度。木聚糖酶酶活的定義為:每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol木糖的木聚糖酶活力為1個(gè)活力單位。

2　結(jié)果與分析

2.1　誘導(dǎo)溫度對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響

在誘導(dǎo)溫度為26～30 ℃范圍內(nèi)，重組畢赤酵母的生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶活力的情況分別見(jiàn)圖1-a和圖1-b。重組畢赤酵母在這4個(gè)溫度梯度下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞濃度不斷升高，并在誘導(dǎo)96 h時(shí)達(dá)到最高值。然后細(xì)胞濃度開(kāi)始下降。相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，重組畢赤酵母在30 ℃的條件下有較高的細(xì)胞濃度。重組畢赤酵母在30 ℃誘導(dǎo)96 h后達(dá)到最高的細(xì)胞濃度為20.4 OD600。重組畢赤酵母表達(dá)的木聚糖酶活力隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高，在誘導(dǎo)96 h時(shí)均達(dá)到最高值，然后酶活力下降?？傮w上看，不同誘導(dǎo)溫度下的木聚糖酶活力差別不顯著。重組畢赤酵母在30 ℃條件下誘導(dǎo)96 h后達(dá)到最高木聚糖活力(1 410.2 U/mL)。

圖1　誘導(dǎo)溫度對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響Fig.1　Effects of temperature on the recombinant K. phaffiigrowth and xylanase activity

2.2　pH對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響

pH對(duì)重組畢赤酵母的生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響見(jiàn)圖2-a和圖2-b。在誘導(dǎo)24 h內(nèi)，不同pH條件下的細(xì)胞濃度差別不明顯。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，pH 5.0條件下的重組畢赤酵母細(xì)胞濃度保持穩(wěn)定，并在誘導(dǎo)120 h后出現(xiàn)下降。其他pH條件下重組畢赤酵母細(xì)胞濃度不斷升高，并在誘導(dǎo)96 h時(shí)達(dá)到最高的細(xì)胞濃度。重組畢赤酵母在pH 5.5條件下誘導(dǎo)96 h時(shí)達(dá)到最高值(27.6 OD600)。重組畢赤酵母表達(dá)的木聚糖酶活力隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高，并在96 h時(shí)達(dá)到最高的木聚糖酶活力。然后木聚糖酶活力保持穩(wěn)定。在pH 5.5的條件下，木聚糖酶活力達(dá)到的最高值為2 602.8 U/mL。

圖2　誘導(dǎo)pH對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響Fig.2　Effects of pH on the recombinant K. phaffiigrowth and xylanase activity

2.3　甲醇添加量對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響

甲醇添加量對(duì)重組畢赤酵母的生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶活力的影響見(jiàn)圖3-a和圖3-b。

圖3　甲醇添加量對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響Fig.3　Effects of methanol added on the recombinantK. phaffii growth and xylanase activity

重組畢赤酵母的細(xì)胞濃度隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高，并在誘導(dǎo)96 h時(shí)達(dá)到最高值，然后細(xì)胞濃度逐漸下降。在1.0%甲醇誘導(dǎo)96 h的條件下，重組畢赤酵母的細(xì)胞濃度達(dá)到最高值為34.9 OD600。木聚糖酶活力也在1.0%甲醇誘導(dǎo)96 h時(shí)達(dá)到最高值(3 403.8 U/mL)，然后木聚糖酶活力出現(xiàn)下降。

2.4　甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響

山梨醇是一種畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子的非抑制性碳源。山梨醇的添加可以為細(xì)胞提供額外的能量，提高細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源蛋白的產(chǎn)量[16]。甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)能夠使畢赤酵母保持誘導(dǎo)強(qiáng)度的同時(shí)提供充足的能量。重組畢赤酵母的細(xì)胞濃度在誘導(dǎo)48 h內(nèi)顯著升高到22～30 OD600，然后逐漸下降。在不同山梨醇的添加量的條件下，重組畢赤酵母細(xì)胞濃度在添加0.05%山梨醇的條件下有最高值32.2 OD600。木聚糖酶活力也隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而不斷升高。但是不同山梨醇添加量的條件下木聚糖酶活力差別不明顯。木聚糖酶在誘導(dǎo)120 h時(shí)達(dá)到最高值(2 615.3 U/mL)。甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)在120 h達(dá)到最高點(diǎn)，而其中山梨醇添加量為0.08%時(shí)，在120 h得到最大酶活2 615.3 U/mL。相比于甲醇添加量為1%時(shí)在96 h處達(dá)到的最大酶活3 403.8 U/mL，為甲醇誘導(dǎo)時(shí)木聚糖酶活力的76.8 %。

圖4　甲醇/山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響Fig.4　Effects of methanol and sorbitol on recombinantK. phaffii growth and xylanase activity

2.5　甲酸銨誘導(dǎo)重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶

在甲酸銨添加量為0.5%～5.0%的范圍內(nèi)，重組畢赤酵母細(xì)胞濃度逐漸升高，在誘導(dǎo)48 h后達(dá)到穩(wěn)定。重組畢赤酵母在0.5%甲酸銨的條件下有最高的細(xì)胞濃度。甲酸銨添加量升高到2.0%時(shí)對(duì)重組畢赤酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)有微弱的抑制作用。甲酸銨在5.0%添加量對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。木聚糖酶活力在初始誘導(dǎo)24 h升高明顯(約1 000 U/mL)，然后出現(xiàn)微弱下降。不同甲酸銨添加量對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶的影響差別不顯著(圖5)。

圖5　甲酸銨添加量對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響Fig.5　Effects of ammonium formate added on therecombinantK. phaffii growth and xylanase activity

在甲酸銨誘導(dǎo)的條件下，測(cè)定了0～144 h內(nèi)重組畢赤酵母的AOX活力(圖6)。在1.0%甲酸銨的條件下，誘導(dǎo)24 h時(shí)的AOX活力最高為6.3 U/mL，在24～144 h內(nèi)，甲酸銨誘導(dǎo)下的AOX活力呈現(xiàn)逐漸下降，在誘導(dǎo)144 h后AOX活力降低到2.7 U/mL。這與甲酸銨誘導(dǎo)下重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶的活力在24～144 h下降的結(jié)果一致。

圖6　甲酸銨誘導(dǎo)下AOX活力的變化Fig.6　AOX activity of recombinant K. phaffiiinduced by ammonium Formate

2.6　甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響

重組畢赤酵母在甲酸銨和山梨醇混合添加的條件下生長(zhǎng)至48 h，達(dá)到最高值，然后保持穩(wěn)定。木聚糖酶活力在甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高。木聚糖酶在誘導(dǎo)72 h后達(dá)到最高活力(2 032.0 U/mL)，然后出現(xiàn)微弱下降(圖7)。

圖7　甲酸銨/山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響Fig.7　Effects of combined ammonium formate and sorbitolon recombinant K. phaffii growth and xylanase activity

2.7　甲醇和甲酸銨聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響

重組畢赤酵母在每天1%甲醇和不同量的甲酸銨的條件下繼續(xù)生長(zhǎng)至誘導(dǎo)到48 h，然后細(xì)胞濃度保持穩(wěn)定。在添加0.5%甲酸銨時(shí)的細(xì)胞濃度約為15 OD600，顯著低于其他甲酸銨添加量組別的細(xì)胞濃度。甲酸銨添加1.0%及以上時(shí)，細(xì)胞濃度穩(wěn)定在約20 OD600。木聚糖酶活力隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高。誘導(dǎo)72 h后，在所有甲酸銨添加的組別中木聚糖酶活力都達(dá)到最高值，然后明顯下降。木聚糖酶活力在甲酸銨添加量為1.5%的條件下有最高活力(3 589.2 U/mL)(圖8)。

圖8　甲醇/甲酸銨聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)重組畢赤酵母生長(zhǎng)和表達(dá)木聚糖酶的影響Fig.8　Effects of combined methanol and ammoniumformate on recombinant K. phaffii growth and xylanase activity

3　討論

畢赤酵母作為外源蛋白表達(dá)的宿主已經(jīng)廣泛應(yīng)用到多種重組蛋白的表達(dá)。而且，大約有70多種來(lái)自畢赤酵母的重組蛋白被推向市場(chǎng)。但是完善畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的工作仍在繼續(xù)。一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)就是非甲醇誘導(dǎo)劑的開(kāi)發(fā)。目前開(kāi)發(fā)非甲醇誘導(dǎo)的方式主要分為3個(gè)方向。第1個(gè)是開(kāi)發(fā)其他非甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。例如3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(PGAP)啟動(dòng)子可以利用甘油誘導(dǎo)[9]，與鳥(niǎo)苷三磷酸酶分泌相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子(PYPT1)[10]，二強(qiáng)丙酮合成酶啟動(dòng)子(PDHAS)[11]，甲醛脫氫酶啟動(dòng)子(FLD1)[12]。乙醇誘導(dǎo)的異檸檬酸裂解酶啟動(dòng)子(PICL1)[13]。轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子1-α啟動(dòng)子(PTEF1)[14], 3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(PPGK1)[15]。但是這些非甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度都沒(méi)有達(dá)到AOX1的表達(dá)強(qiáng)度，造成外源蛋白表達(dá)量不高。第2個(gè)是改造AOX啟動(dòng)子序列，以企得到非甲醇誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)AOX1的畢赤酵母工程菌株。研究AOX1啟動(dòng)子上游序列的調(diào)控原件和調(diào)控蛋白因子是近年來(lái)的熱點(diǎn)方向。根據(jù)目前的研究結(jié)果，Vogl等合成了一個(gè)畢赤酵母的核心啟動(dòng)子序列，進(jìn)而調(diào)控不同的表達(dá)強(qiáng)度，也為研究其他非甲醇誘導(dǎo)物提供基礎(chǔ)[17]。HARTNER等通過(guò)一系列人工調(diào)整AOX1啟動(dòng)子序列將報(bào)告基因表達(dá)量提高60%[18]。WANG通過(guò)敲除AOX1啟動(dòng)子上游的3個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子和1個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子得到甘油啟動(dòng)的AOX1表達(dá)元件。這株重組畢赤酵母表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)可以到達(dá)甲醇誘導(dǎo)AOX1的77%的水平[19]。并且，構(gòu)建了另外一株非甲醇誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子可以達(dá)到甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的50%的水平[20]。第3個(gè)方面是尋找誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子的非甲醇誘導(dǎo)劑。例如KUMARI巧妙地利用脂肪酸甲酯誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)脂肪酶，脂肪酶水解脂肪酸甲酯釋放出的甲醇誘導(dǎo)重組畢赤酵母[21]。但是這種方式不能被推廣到表達(dá)其他酶的重組畢赤酵母中。TYURIN利用甲酸誘導(dǎo)2株重組畢赤酵母的β-半乳糖苷酶的活性分別達(dá)到甲醇誘導(dǎo)水平的35%和95%[22]。本研究以表達(dá)木聚糖酶的重組畢赤酵母為試材，確定甲醇誘導(dǎo)的最優(yōu)條件(溫度30℃，pH 5.5，甲醇添加量為1.0 %)和木聚糖酶的最高活力(3 403.8 U/mL)。進(jìn)而探討了甲酸銨誘導(dǎo)AOX1的強(qiáng)度。圖6結(jié)果表明甲酸銨誘導(dǎo)AOX1的強(qiáng)度較弱。利用甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)木聚糖酶的體積產(chǎn)量達(dá)到2 032.0 U/mL。甲醇和甲酸銨聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)木聚糖酶的體積產(chǎn)量可以達(dá)到3 589.2 U/mL。這說(shuō)明甲酸銨增加了甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)AOX1的強(qiáng)度。表1分析了不同實(shí)驗(yàn)條件下的單位重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶的結(jié)果。由表1可知甲酸銨誘導(dǎo)下，單位畢赤酵母細(xì)胞濃度的木聚糖酶活力為39.9 U/mL OD600，為甲醇誘導(dǎo)時(shí)單位畢赤酵母細(xì)胞濃度的木聚糖酶活力(97.5 U/mL OD600)的40.9%。添加0.5%山梨醇后，0.5%甲酸銨誘導(dǎo)畢赤酵母的單位細(xì)胞濃度的木聚糖酶活力達(dá)到150.5 U/mL OD600，比1.0%甲醇和0.08%山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)單位細(xì)胞濃度木聚糖酶活力(113.7 U/mL OD600)提高了32.4%。這說(shuō)明畢赤酵母單獨(dú)代謝甲酸的通量不大，添加山梨醇提供了表達(dá)外源蛋白的能源后，提高了外源蛋白的表達(dá)。而且甲酸銨和山梨醇更有利于畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)木聚糖酶。不足之處在于甲酸銨和山梨醇誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，細(xì)胞濃度較低，為甲醇和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞濃度的58.7%。所以在發(fā)酵罐上利用細(xì)胞生長(zhǎng)階段和誘導(dǎo)階段分開(kāi)培養(yǎng)的方式將有利于甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的體現(xiàn)。

表1　單位重組畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)木聚糖酶的比較Table 1　Specific xylanase activities at different induction conditions

本研究還探討了甲酸銨對(duì)甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶的影響。甲酸銨和甲醇聯(lián)合誘導(dǎo)畢赤酵母時(shí)單位細(xì)胞濃度的木聚糖酶活力達(dá)到217.5 U/mL OD600。這表明甲醇和甲酸銨聯(lián)合誘導(dǎo)有利于AOX1對(duì)外源蛋白的表達(dá)，而且表明畢赤酵母還有提高表達(dá)木聚糖的空間，為將來(lái)研究甲酸銨誘導(dǎo)畢赤酵母的一個(gè)內(nèi)容。但是甲酸銨誘導(dǎo)的條件下畢赤酵母的細(xì)胞濃度顯著低于甲醇誘導(dǎo)時(shí)的生物量。所以，在畢赤酵母高密度發(fā)酵時(shí)，甲酸銨和山梨醇聯(lián)合誘導(dǎo)將更有利于畢赤酵母表達(dá)外源蛋白。本研究為非甲醇類(lèi)物質(zhì)誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)外源蛋白提供了基礎(chǔ)。

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