張 丹,王小旭,謝賀賀，吳翠栓

(北京德立福瑞醫(yī)藥科技有限公司,北京 102101)

美洛昔康是一種新型非甾體抗炎藥(NSAIDs)，用于治療骨關節(jié)炎和類風濕關節(jié)炎[1-2]，與其他NSAIDs相比，引起的胃腸道不良反應更輕[3-4]。但由于美洛昔康的水溶性較差，導致口服生物利用度較低。

口服納米骨架技術[5-7]是采用具有納米孔徑的介孔二氧化硅和pH敏感高分子材料為載體，制備難溶性藥物納米骨架分散系統(tǒng)。本研究采用納米骨架技術制備美洛昔康納米骨架膠囊，并與市售美洛昔康片(莫比可?)進行對比，對自制的美洛昔康納米骨架膠囊進行體外溶出特征和比格犬體內口服藥物代謝動力學研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);RC806D型溶出儀(天大天發(fā)科技有限公司);T6新世紀型紫外可見分光光度計(普析通用儀器有限責任公司);AL204型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);BT 25S型電子天平(德國賽多利斯公司);HC-2064型離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);MTN-2800W型氮吹濃縮裝置(天津奧特賽思儀器有限公司)。

1.2試藥 美洛昔康對照品(批號100679-201102)和吡羅昔康對照品(批號100177-200603)，均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，Sigma公司，批號WXBB6447V)；美洛昔康片(商品名莫比可?，勃林格殷格翰公司，批號384242)；美洛昔康納米骨架膠囊(北京德立福瑞醫(yī)藥科技有限公司，批號MJ201502282)；水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

1.3動物 健康比格犬，10月齡左右，雄性，體質量為8～10 kg，購自北京瑪斯生物技術有限公司，實驗動物許可證號為SCXK(京)-2011-0003。

2 方法與結果

2.1溶出曲線對比研究

2.1.1溶出曲線測定 取美洛昔康納米骨架膠囊，參照《中國藥典》2015年版通則0931第二法溶出度與釋放度測定法，溶出介質體積為900 mL，轉速為75 r·min-1，依法操作。經(jīng)5、10、30、45、60 min時，取溶液10 mL，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取美洛昔康對照品約20 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加 0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液10 mL，超聲使溶解，再用溶出介質稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置于50 mL量瓶中，用溶出介質稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；取上述供試品溶液和對照品溶液，參照《中國藥典》2015年版通則0401紫外-可見分光光度法，在362 nm波長處分別測定吸光度值A，按外標法計算每片溶出量。

2.1.2溶出曲線測定方法學驗證 專屬性:稱取輔料適量，分別加入不同pH值的溶出介質，過濾，在362 nm波長處測定吸光度值A。結果顯示，空白輔料溶液在該波長處均無吸收，未對主成分造成干擾，表明該方法專屬性良好。

線性范圍：精密稱取美洛昔康對照品適量，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液使溶解，再加介質稀釋成質量濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg·L-1的系列溶液，以該溶出介質為空白，分別在波長362 nm處測定其吸光度值A，以吸光度(A)對美洛昔康質量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程：A1=0.050 4C1+0.002 2，R12=0.999 8(pH=1.0);A2=0.052 5C2+0.003 6，R22=0.999 3(pH=4.5)；A3=0.050 9C3+0.003，R32=0.999 8(水)；A4=0.053 6C4+0.000 6，R42=0.999 6(pH=7.4)。結果表明，美洛昔康質量濃度(C)在0.25～8.00 mg·L-1范圍內與吸光度(A)線性關系良好。

2.1.3溶出曲線對比 按照上述溶出曲線測定方法，分別測定2種制劑在不同pH介質中的溶出曲線。結果表明，對照品制劑莫比可?在pH值為1.0的鹽酸介質中，60 min時溶出度低于20%，在pH值為4.5的醋酸鹽介質中，60 min溶出度低于40%，在水和pH值為7.4的磷酸鹽介質中，30 min溶出度約為80%，呈現(xiàn)明顯的pH值依賴性；而美洛昔康納米骨架膠囊在4種介質中溶出均快于莫比可?，且在酸性介質中溶出度明顯提高。溶出曲線見圖1。

2.2比格犬體內的藥動學對比研究

2.2.1給藥方案與血漿樣品采集 本研究為單劑量給藥實驗，采用兩周期雙交叉實驗設計，周期間隔為7 d。將12只比格犬隨機分為2組，禁食12 h后分別口服美洛昔康納米骨架膠囊與莫比可?。分別于給藥前(0 h)和給藥后 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、12.0、36.0、72.0 h由前腿小隱靜脈采血2 mL。血樣取出后立即置于肝素化的EP管中，以4 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，于-20 ℃冰箱冷凍保存， 待測。

2.2.2血漿樣品處理方法 精密吸取血漿0.5 mL，置于5 mL具塞離心管中，精密加入內標溶液50 μL，1.0 mol·L-1的鹽酸溶液100 μL，乙醚4.0 mL(分2次，每次2 mL)，渦旋混勻2 min，以4 000 r·min-1離心10 min，合并2次有機相，于50 ℃水浴中氮氣吹干。殘留物以200 μL流動相渦旋1 min溶解，高速離心后，取上清液供HPLC分析。

2.2.3色譜條件 色譜柱：MERCK Hibar?RP-18e(150 mm×4.6 mm 5.0 μm)；流動相：甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨=52∶48；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：355 nm；進樣體積：20 μL。

2.2.4方法學驗證 專屬性:按照2.2.3項下色譜條件測得空白血漿、空白血漿加美洛昔康對照品和內標(吡羅昔康)及比格犬服藥后血漿樣品的典型色譜圖，美洛昔康的保留時間約為14.249 min，內標吡羅昔康的保留時間約為7.743 min；空白血漿的內源性物質未干擾色譜分析。

線性范圍：精密稱取美洛昔康對照品10.0 mg，置于200 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液10 mL使其溶解，用水稀釋至刻度，得到50 μg·mL-1的美洛昔康溶液，作為儲備液；在空白血漿中加入不同質量濃度的美洛昔康對照品溶液，使其血漿藥物質量濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.500、1.000、5.000 μg·mL-1，按照2.2項下血漿處理方法處理，進行HPLC分析。以峰面積比(R)對質量濃度(C,μg·mL-1)進行線性回歸，得回歸方程：C=R×2.121 1-0.015 6，r=0.999 9。結果表明，美洛昔康血漿質量濃度在0.025～5.000 μg·mL-1范圍內，線性關系良好。

定量下限：分別精密吸取美洛昔康對照品溶液適量，置于5 mL具塞離心管中，氮氣吹干，加入空白血漿0.5 mL，配制成美洛昔康質量濃度為0.025 μg·mL-1的血漿樣本5份，按照2.2項下方法處理，代入標準曲線計算，結果5份樣品平均準確度為105.26%，RSD值為9.98%。表明質量濃度在最低定量限附近的血漿樣本測定準確度、精密度良好。

精密度與準確度：另精密稱取美洛昔康對照品10.0 mg，置于200 mL量瓶中，加0.1 μg·mL-1的氫氧化鈉溶液10 mL使其溶解，用水稀釋至刻度，得到質量濃度為50 μg·mL-1的美洛昔康溶液，作為儲備液；在空白血漿中加入不同質量濃度的美洛昔康對照品溶液，制成血漿藥物質量濃度分別為0.025、0.050、0.500、5.000 μg·mL-1的血漿樣品。按照2.2項下方法處理，進行HPLC分析。在1個分析批內測定多次，計算批內精密度；在不同時間連續(xù)制備并測定3個分析批，計算批間精密度。見表1。

表1 美洛昔康血漿樣品精密度測定

提取回收率：美洛昔康回收率實驗：取美洛昔康對照品溶液，加入空白血漿中，配制成質量濃度為0.025、0.050、0.500、4.000 μg·mL-1的血漿樣品，各5份，置于5 mL具塞離心管中，加入1.0 mol·L-1的鹽酸溶液100 μL及乙醚4.0 mL(分2次，每次2 mL)，渦旋混勻2 min，以4 000 r·min-1離心10 min，合并2次有機相，于上清液中精密加入內標(吡羅昔康)溶液50 μL，渦旋混勻后于50 ℃水浴中氮氣吹干。殘留物以200 μL流動相渦旋1 min溶解，高速離心后，取上清液供HPLC分析。計算美洛昔康與內標的色譜峰面積比(As-r)。另取空白血漿6份，加入1.0 mol·L-1的鹽酸溶液100 μL，乙醚4.0 mL(分2次，每次2 mL)，渦旋混勻2 min，以4 000 r·min-1離心10 min，合并2次有機相，加入與前一步驟等量的美洛昔康對照品溶液適量，配成系列質量濃度水平對照品溶液，各2份，再分別精密加入內標溶液50 μL，渦旋混勻后于50 ℃水浴中氮氣吹干。殘留物以200 μL流動相渦旋1 min溶解，高速離心后，取上清液供HPLC分析，計算美洛昔康與內標的色譜峰面積比(Ar-r)。按照公式回收率=(As-r)÷(Ar-r)×100%計算美洛昔康血漿樣品的回收率，結果表明,4種質量濃度的平均回收率均大于80%，且穩(wěn)定。見表2。

表2 美洛昔康血漿樣品回收率 (n=5)

內標吡羅昔康回收率實驗：取空白血漿0.5 mL，共5份，置于5 mL具塞離心管中，按照2.2.2項下血漿樣品處理方法自“精密加入內標(吡羅昔康)溶液50 μL”起同法操作，并進行色譜分析，記錄內標色譜峰面積(As-is)。另取空白血漿2份，加入1.0 mol·L-1的鹽酸溶液100 μL，乙醚4.0 mL(分2次，每次2 mL)，渦旋混勻2 min，以4 000r·min-1離心10 min，合并2次有機相，于上清液中精密加入內標(吡羅昔康)溶液50 μL，渦旋混勻后于50 ℃水浴中氮氣吹干。殘留物以200 μL流動相渦旋1 min使溶解，高速離心后，取上清液供HPLC分析。記錄內標的色譜峰面積(Ar-is)。按照公式回收率=(As-is)÷(Ar-is)×100%計算內標血漿樣品的回收率。結果表明，在內標質量濃度為5.0 μg·mL-1時，5份樣品中內標的回收率分別為90.24%、87.16%、91.38%、92.44%、89.09%，平均回收率為90.06%，RSD值為2.27%，內標在該質量濃度水平的平均回收率大于80%且穩(wěn)定。

穩(wěn)定性：按照標準曲線測定方法配制0.05、0.50、5.00 μg·mL-13種不同質量濃度的血漿樣品，分別考察未處理血漿樣品室溫放置8 h、凍融循環(huán)3次、-20 ℃冰凍15 d、處理后血漿樣品自動進樣器放置48 h的穩(wěn)定性。經(jīng)測定，3種質量濃度樣品在不同條件放置后，所測得的質量濃度與標示質量濃度偏差均在±15%范圍內，結果表明，穩(wěn)定性符合要求。綜上，高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)方法的驗證結果表明，該方法的專屬性、線性范圍、精密度、準確度、定量限、提取回收率和穩(wěn)定性等均符合要求，可用于美洛昔康血藥質量濃度的測定。

2.2.5比格犬體內藥動學參數(shù)比較 比格犬體內藥動學參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉化后進行方差分析，采用雙向單側t檢驗及[1-2α]%置信區(qū)間法進行生物等效性評價。結果與莫比可?相比，美洛昔康納米骨架膠囊經(jīng)對數(shù)轉換后的藥物達峰濃度(Cmax)的90%置信區(qū)間為135.3%～154.8%，藥時曲線下面積(AUC0～t)的90%置信區(qū)間為104.5%～179.0%，相對生物利用度(F0～72)=136.8%。2種制劑在比格犬體內藥動學參數(shù)見表3，平均藥-時曲線見圖2。

圖2 口服2種制劑后的平均藥-時曲線

表3 美洛昔康在比格犬體內藥動學參數(shù)

3 討論

美洛昔康納米骨架膠囊是以具有納米孔徑的二氧化硅和pH敏感材料為主要載體，使難溶性藥物美洛昔康高度分散，從而制備成的高溶出度、高生物利用度的制劑。其能提高體外溶出及體內吸收，是因為二氧化硅的巨大比表面積具有很強的吸附作用，使藥物分散在其中，與溶出介質的接觸面積更大，釋放速率更快，且更小的粒徑使藥物的遷移變得更加容易，能夠提高藥物與胃腸道的接觸面積，增加藥物的生物利用度。另外，將藥物制成固體分散體時易發(fā)生晶型轉變，藥物晶型由結晶轉變?yōu)闊o定形，在溶解過程中，無需能量破壞藥物的晶格結構，大大提高了藥物的溶出速率，同時載體還可作為藥物結晶的抑制劑來穩(wěn)定處于高能態(tài)的無定形藥物的存在。

根據(jù)生物藥劑學分類，美洛昔康屬于BCS Ⅱ類藥物[8]，溶出是口服吸收的限速步驟，而增加難溶藥物的溶解度對其釋藥速率尤為重要[9-12]。此外，美洛昔康溶解度具有pH依賴性，在酸性介質中溶解度低[13]，圖2中莫比可?在酸性介質中的溶出行為有相應體現(xiàn)。而圖2顯示美洛昔康納米骨架膠囊在酸性介質中的主藥溶出度顯著提高，從而確保了其在腸道內更快吸收。體現(xiàn)在比格犬體內藥動學對比研究中，與市售莫比可?相比(tmax=3.500 h)，美洛昔康納米骨架膠囊表現(xiàn)出較快的藥物吸收速率(tmax=2.833 h)。此外，藥動學參數(shù)經(jīng)等效性分析表明，相同劑量下，美洛昔康納米骨架膠囊Cmax是莫比可?的1.461倍，AUC0-t是莫比可?的1.319倍，生物利用度提高30%左右。結果表明，美洛昔康納米骨架膠囊顯著提高了主藥在酸性介質中的溶出量，且提升了其在比格犬體內的吸收速度與程度，臨床應用可增強鎮(zhèn)痛效果。

盡管美洛昔康是一種選擇性COX-2抑制劑，但仍存在10%～20%的胃腸道不良反應發(fā)生率[14]，且通常與劑量相關[15]。美國食品藥品管理局(FDA)等專業(yè)醫(yī)學組織的用藥指南中明確強調：NSAIDs應在最短療程內使用最低有效劑量，以降低心血管和胃腸道等毒性風險[16-17]。故在此基礎上可繼續(xù)開發(fā)起效時間快的低劑量美洛昔康制劑，減少藥物用量以減緩胃腸道刺激，該研究為進一步開發(fā)新型美洛昔康制劑及其臨床安全、合理用藥提供了依據(jù)。