葉嘉　張浩　郭海燕　寧輝

摘? ? 要：以大蒜為材料，測定不同處理下蒜氨酸和大蒜素含量并檢測大蒜精油對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果，為開發(fā)大蒜天然抑菌藥物和高效防腐保鮮劑提供參考。結(jié)果表明，施用蚓糞和化肥的大蒜蒜氨酸含量（w，后同）分別為44.05 mg·g-1 和33.86 mg·g-1，大蒜素含量分別為0.33 mg·g-1和0.13 mg·g-1，施用蚓糞的大蒜蒜氨酸和大蒜素含量均顯著高于施用化肥處理;施用蚓糞的大蒜精油得率顯著高于化肥處理;在1.25～40.0 mg·mL-1質(zhì)量濃度內(nèi)，2種施肥處理大蒜提取得到的精油對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的最小抑菌質(zhì)量濃度均為2.5 mg·mL-1，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系;同一濃度處理下，蚓糞處理的大蒜精油對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制作用優(yōu)于化肥處理。

關(guān)鍵詞：大蒜;高壓液相色譜法;蒜氨酸;大蒜素;大蒜精油;抑菌

中圖分類號：S633.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）10-098-06

Effects of vermicompost on alliin and allicin contents and antibacterial activity of garlic oil in garlic

YE Jia1， 2， ZHANG Hao1， 2， GUO Haiyan1， 2， NING Hui1

（1. School of Life Science and Engineering， Handan College， Handan 056005， Hebei， China; 2. Wild Plant Resources Research Centre in Taihang Mountain of Southern Hebei， Handan 056005， Hebei， China）

Abstract： In order to provided reference data for the development of natural antibacterial drugs and high-efficiency preservatives， the contents of alliin， allicin and the inhibitory effect of garlic oil on Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium were detected. The results showed that the contents of alliin were 44.05 mg·g-1 and 33.86 mg·g-1， after treated by vermicompost and chemical fertilizer respectively， and allicin were 0.33 mg·g-1 and 0.13 mg·g-1， respectively. The contents of alliin and allicin treated with vermicompost were significantly higher than those of fertilizer treatment. The yield of garlic essential oil in vermicompost substrate was significantly higher than that in fertilizer substrate. The minimum inhibitory concentration of garlic oil contained in vermicompost and chemical fertilizer substrate to Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium was 2.5 mg·mL-1 in the range of 1.25-40.0 mg·mL-1， and it was showed a certain dose effect relationship. With the increase of garlic essential oil concentration， the diameter of bacteriostatic circle of Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium increased gradually. At the same concentration， the inhibition of garlic essential oil in vermicompost matrix on Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium was better than that in fertilizer matrix.

Key words： Garlic; HPLC; Allicin; Alliin; Garlic essential oils; Bacterial inhibition

隨著我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)協(xié)同發(fā)展的不斷加快，如何促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)化發(fā)展成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)種植的關(guān)鍵問題。而肥料施用則成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展過程中的重要組成部分。蚯蚓糞是蚯蚓通過自身降解有機(jī)物的產(chǎn)物。蚓糞可以有效改善土壤的結(jié)構(gòu)，降低土壤的pH值，減小土壤堿化度，從而改善土壤生態(tài)環(huán)境[1]。大量研究表明，施加蚓糞可以明顯促進(jìn)作物生長，提高果實(shí)品質(zhì)[2-4]。

大蒜為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，具有廣譜的抗、抑菌及消炎作用[5]。蒜氨酸和大蒜素是大蒜中重要的生物活性物質(zhì)。研究表明蒜氨酸具有清除自由基、降血糖、抑菌、保肝等生物活性[6]，還能抑制食品中的霉菌，延長食品的防腐保鮮期[7]。蒜氨酸在大蒜酶的催化下可生成大蒜素。大蒜素具有明顯的抑菌作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌等有明顯的抑制作用，已普遍用于食品和醫(yī)藥方面[8]。研究表明，同種大蒜在不同的產(chǎn)地、不同的栽培方式下所含生物活性物質(zhì)也不同[9]。Ghasemi等[10]研究了添加腐殖酸對大蒜生物活性物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)施肥對大蒜的總體抗氧化活性具有顯著的提升作用。Montano等[11]人發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的大蒜體內(nèi)活性物質(zhì)含量差異顯著，蒜氨酸和異蒜氨酸的含量主要受產(chǎn)地影響。Patidar等[12]通過在基質(zhì)中添加蚯蚓糞，發(fā)現(xiàn)添加蚯蚓糞后大蒜中揮發(fā)油含量和產(chǎn)量與對照相比有明顯提高。但目前針對不同肥料栽培的大蒜中活性物質(zhì)的含量變化及抑菌活性的報(bào)道很少。

筆者采用溶劑提取和酶解法得到大蒜粗提物，利用高效液相色譜法對蚓糞處理大蒜與化肥處理大蒜的大蒜素、蒜氨酸含量的差異性進(jìn)行比較，并檢測大蒜提取物對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌活性的抑制效果，為開發(fā)大蒜天然抑菌藥物和高效防腐保鮮劑提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用大蒜品種為河北永年大蒜，施用蚓糞的大蒜購于河北朗力農(nóng)業(yè)科技有限公司，化肥處理大蒜購于河北省邯鄲市永年縣農(nóng)戶。

蚯蚓糞由半腐熟牛糞經(jīng)蚯蚓消化所得，pH值7.14，有機(jī)質(zhì)含量（w，后同）78.4%（以烘干基計(jì)），全氮含量9.86%（以烘干基計(jì)），全磷含量2.45%（以烘干基計(jì)）。

普通化肥處理：尿素（全氮45.6%）、過磷酸鈣（全磷12.3%）。

蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品購于合肥博美生物科技有限公司;金黃色葡萄球菌（CMCC （B） 26003）購于上海魯威科技有限公司;鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）購于合肥博美生物科技有限公司。

主要儀器采用美國產(chǎn)高效液相色譜儀（waters e2695-2489）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年3—6月在邯鄲學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心及邯鄲市永年縣廣府鎮(zhèn)種植區(qū)開展。采用不同肥料對基質(zhì)進(jìn)行處理，蚓糞施入量與化肥中常規(guī)施肥氮含量一致，蚓糞和常規(guī)化肥均作為基肥使用。株行距7 cm×14 cm，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積5 m×5 m，取樣時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)取3次。

1.3 方法

1.3.1 蒜氨酸和大蒜素的提取 首先微波（功率：700 W）高火（T：100 ℃）滅酶蚓糞、化肥處理的大蒜1 min[13]。準(zhǔn)確稱取施用蚓糞和化肥處理的大蒜各5 g，并放入研缽中搗碎，采用水作為提取劑，料液比1∶9，提取時(shí)間1 h，在12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液即為待測液。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)再檢測3次。

分別稱量5 g蚓糞、化肥處理的大蒜，于研缽中搗碎，40 ℃水浴酶解1 h，采用85% 甲醇作為提取劑，物料比1∶4，35 ℃水浴提取1 h[14]，在12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液即為待測液。3次重復(fù)，每次試驗(yàn)再檢測3次。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和樣品的檢測 取蒜氨酸標(biāo)品20 mg，用超純水定容到10 mL容量瓶內(nèi)，配成2 mg·mL-1母液。然后依次配成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。參考常軍民等[15]的HPLC條件，波長：214 nm;流動(dòng)相：甲醇∶水=30∶70;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣體積：20 μL;流速：0.8 mL·min-1。以峰面積為縱坐標(biāo)，蒜氨酸質(zhì)量濃度（計(jì)為mg·g-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算樣品含量。

取大蒜素標(biāo)品0.5 g，用 85% 甲醇定容到 250 mL容量瓶內(nèi)，配成2 mg·mL-1母液。然后依次配成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。參考譚志靜[16]的高效液相的色譜條件，波長：214 nm;流動(dòng)相：甲醇∶水=85∶15;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣體積：20 μL流速：0.8 mL·min-1。以峰面積為縱坐標(biāo)，大蒜素濃度（計(jì)為mg·g-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算樣品含量。

采用高效液相色譜儀（waters e2695-2489），色譜柱為Symmetry-C18（4.6 mm×250 mm，0.5 μm），將配置好的蒜氨酸和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣檢測獲得色譜圖。

1.3.3 大蒜精油的制備 分別稱取500 g 不同肥料種植的大蒜，于研缽中搗碎，選用二氯甲烷為萃取劑，料液比1∶4，萃取時(shí)間3 h，得到的萃取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮，濃縮液在通風(fēng)良好、無光的地方用0.45 μm的微孔濾膜中過濾，利用便攜式氣體檢測儀檢測二氯甲烷，待濾液中二氯甲烷揮發(fā)干凈，得到大蒜精油純品，密封保存，備用，重復(fù)6次并計(jì)算得率。

1.3.4 不同種植基質(zhì)的大蒜精油的抑菌活性測定 培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA），調(diào)pH至7.6，121 ℃滅菌30 min。用滅菌的接種環(huán)將兩種細(xì)菌接種到 NA 液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，進(jìn)行活化?；罨蟛捎闷桨逵?jì)數(shù)的方法計(jì)算原菌液的數(shù)量，冷藏、備用。

利用逐級稀釋的方法將菌懸液濃度調(diào)整為106 CFU·mL-1，用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法評價(jià)不同種植基質(zhì)大蒜精油對不同菌株的抑菌影響。首先用打孔器將濾紙打成直徑為6 mm的圓形紙片，121 ℃滅菌 20 min后，60 ℃烘干。取濾紙圓片，置于提取的大蒜精油稀釋液中，大蒜精油用少量吐溫-80助溶，用無菌水溶解。稀釋液設(shè)置為1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·mL-1 6個(gè)質(zhì)量濃度，同時(shí)用無菌水作空白對照，4 mg·mL-1青霉素G鈉組作陽性對照，3 mg·mL-1吐溫-80作陰性對照，浸泡1 h，瀝干。吸取0.2 mL的菌液于培養(yǎng)基，并用經(jīng)高壓蒸汽滅菌的涂布器涂抹均勻。用鑷子取上述圓片，置于培養(yǎng)基表面，倒置平板放置培養(yǎng)箱（37 ℃）中、培養(yǎng)24 h，取出測量抑菌圈直徑。

試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每次試驗(yàn)每個(gè)濃度下操作3次，測量每個(gè)抑菌圈兩個(gè)垂直方向的直徑，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel 軟件統(tǒng)計(jì)各參數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差并作圖，采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜氨酸和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由圖1可知，蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1×107x + 5 165.2，R2 = 0.999 6，表明蒜氨酸在0～0.8 mg·g-1內(nèi)，其濃度和峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

大蒜素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1×108x+249 375，R2 =0.999 5，擬合度良好。表明在0～0.8 mg·g-1內(nèi)大蒜素標(biāo)品濃度和峰面積呈現(xiàn)較佳的線性關(guān)系。

2.2 蒜氨酸和大蒜素樣品的測定

由圖2可以看出，采用高效液相色譜儀（waters e2695-2489），色譜柱為Symmetry-C18（4.6 mm×250 mm，0.5 μm），將不同處理的大蒜樣品進(jìn)樣檢測獲得色譜圖。

由表1可以看出，在流動(dòng)相V甲醇∶V水=30∶70、214 nm波長下，不同肥料處理之間大蒜所含蒜氨酸含量差異極顯著。施用蚓糞的大蒜蒜氨酸含量（w，后同）為44.05 mg·g-1，是化肥處理大蒜的1.3倍，施用蚓糞大蒜中的蒜氨酸含量極顯著高于化肥處理。

在流動(dòng)相V甲醇∶V水=85∶15、214 nm波長下，施用蚓糞大蒜中大蒜素含量（w，后同）為0.33 mg·g-1，化肥種植大蒜所含大蒜素含量僅為0.13 mg·g-1，施用蚓糞大蒜中大蒜素含量極顯著高于化肥處理。

2.3 不同肥料處理大蒜的大蒜精油的得率

由表2可以看出，在二氯甲烷為萃取劑，料液比1∶4，萃取時(shí)間3 h的條件下，施用蚓糞大蒜精油得率為0.24%，化肥處理大蒜精油得率為0.16%。利用SPSS 軟件對不同肥料處理大蒜精油進(jìn)行得率差異分析，表明不同肥料處理的大蒜精油的含量有極顯著差異。

2.4 不同種植肥料的大蒜精油的抑菌作用

2.4.1 不同濃度的蚓糞和化肥種植大蒜的大蒜精油對金黃色葡萄球菌的抑菌作用 由表3可看出，無論是施用蚓糞還是化肥，當(dāng)大蒜精油質(zhì)量濃度為1.25 mg·mL-1時(shí)，對金黃色葡萄球菌均無顯著抑制效果。二者均在2.5 mg·mL-1出現(xiàn)抑菌圈直徑顯著大于空白對照，因此最低抑菌質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1。

施用不同濃度蚓糞大蒜的大蒜精油對金黃色葡萄球菌的抑制效果具有極顯著性差異;隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增大，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑呈增大的趨勢。當(dāng)大蒜精油質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到最大，是空白對照的2.5倍，同時(shí)顯著高于陽性對照。

與之趨勢相同，不同濃度大蒜精油對金黃色葡萄球菌的抑制作用也具有極顯著性差異。隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增大，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑呈增大的趨勢。

相同濃度大蒜精油處理下，施用蚓糞的大蒜中大蒜精油質(zhì)量濃度在2.5～40.0 mg·mL-1范圍內(nèi)對金黃色葡萄球菌的抑制效果均高于化肥處理。

2.4.2 不同濃度的蚓糞和化肥種植大蒜精油對沙門氏菌的抑菌作用 由表4可知，當(dāng)大蒜精油質(zhì)量濃度為1.25 mg·mL-1時(shí)，施用蚓糞大蒜精油對沙門氏菌菌的抑菌圈直徑與空白對照相比差異不顯著。當(dāng)大蒜精油質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1時(shí)，沙門氏菌菌的抑菌圈直徑顯著高于空白對照，表明施用蚓糞大蒜所含大蒜精油最低抑菌質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1。隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增加，沙門氏菌菌的抑菌圈直徑逐漸增大，當(dāng)大蒜精油質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到最大，是空白對照的1.68倍。

化肥處理大蒜中大蒜精油最低抑菌質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1。隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增加，沙門氏菌菌的抑菌圈直徑呈逐漸增大的趨勢，當(dāng)大蒜精油質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到最大，與空白對照相比，抑菌圈直徑增加了65.33%。

隨著大蒜精油質(zhì)量濃度的增大，對沙門氏菌的抑菌圈直徑逐漸增大。而不同肥料種植的大蒜所含大蒜精油的抑菌效果，在質(zhì)量濃度為1.25、20.0 mg·mL-1時(shí)差異不顯著（p>0.05）。在2.5～10 mg·mL-1范圍內(nèi)，兩種肥料種植的大蒜所含大蒜精油的抑菌效果差異極顯著（p<0.01）。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5、5、10 mg·mL-1時(shí)，蚓糞處理大蒜精油對沙門氏菌菌的抑菌圈直徑與化肥處理相比分別提高3.13%、2.61%和2.72%。同時(shí)，大蒜精油質(zhì)量濃度為40.0 mg·mL-1時(shí)，不同肥料種植的大蒜精油對沙門氏菌的抑制效果也有極顯著差異（p<0.01）。此濃度下蚓糞處理比化肥處理的大蒜精油對沙門氏菌菌的抑菌圈直徑高1.71%。

3 討論與結(jié)論

種植肥料不同對大蒜素、蒜氨酸含量有一定的影響。本研究中，不同肥料種植的大蒜中大蒜素、蒜氨酸含量差異均極顯著，施用蚓糞的大蒜中蒜氨酸及大蒜素含量高于化肥種植?？赡苁怯捎诜柿鲜峭寥婪柿Φ闹饕獊碓矗煌柿系姆柿蜖I養(yǎng)物質(zhì)含量不同，造成土壤中有機(jī)質(zhì)含量的差異。研究表明，蚓糞中富含IAA和GA3等植物激素，可以明顯促進(jìn)植物生長，改善品質(zhì)[17]。施加蚯蚓糞能夠顯著增加土壤中速效磷和堿解氮含量，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長，增加植物的生物量和蛋白質(zhì)含量[18]。蚓糞有機(jī)質(zhì)含量高，土壤酶的活性和易被吸收的活性有機(jī)質(zhì)含量就會(huì)高，則土壤營養(yǎng)物質(zhì)就會(huì)更加豐富，從而改善大蒜的品質(zhì)，提高大蒜素、蒜氨酸的含量。

大蒜種植肥料不同，提取的的大蒜精油抑菌活性也有差異。筆者發(fā)現(xiàn)同一濃度處理下，施用蚓糞的大蒜所含的大蒜精油對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果優(yōu)于化肥種植。大蒜提取物中主要的殺菌、抑菌成分是一些含硫化合物，大蒜素也是其中的一種，這些化合物能夠與細(xì)菌生長繁殖所必需的半胱氨酸分子中的巰基相結(jié)合，或使巰基酶失活從而抑制其生長和繁殖[19]。蒜氨酸中的氧原子也能與半胱氨酸結(jié)合，阻礙胱氨酸的合成，從而抑制微生物生長[7]。此外，姚芹等[20]研究了大蒜素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)大蒜素的抑菌活性隨著大蒜素濃度的升高而增強(qiáng)。何玉林等[21]也發(fā)現(xiàn)大蒜提取物的抑菌活性隨著濃度的升高而增強(qiáng)。本研究中，基質(zhì)中添加蚓糞后，大蒜中大蒜素和蒜氨酸含量顯著升高，其中大量的含硫化合物與半胱氨酸結(jié)合，影響了微生物中氧化還原反應(yīng)，在抑菌方面與化肥種植相比體現(xiàn)出了差異性。這與前人研究結(jié)果一致。

筆者通過HPLC檢測了不同肥料種植的蒜氨酸、大蒜素含量，探究了不同肥料種植的大蒜精油對2種不同細(xì)菌活性的影響，結(jié)果表明，施用蚓糞的大蒜中蒜氨酸及大蒜素含量顯著高于化肥處理，且施用蚓糞的大蒜所含的大蒜精油對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果優(yōu)于化肥處理。結(jié)果可以為開發(fā)大蒜天然抑菌藥物和高效防腐保鮮劑提供理論依據(jù)。

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