張平弟，宣 佶，吳永豐

（1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)，南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210000）

乳腺癌是女性腫瘤中死亡率較高的惡性腫瘤，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展以及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)，分子靶向藥物治療成為乳腺癌的一種新型治療方法[1]。靶向治療的關(guān)鍵之一在于潛在治療靶點(diǎn)的篩選，研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA（ncRNA）與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)[2]。長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（long non-coding Ribonucleic Acid,lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）均屬于非編碼RNA，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，且lncRNAs 可與miRNA、信使RNA（messenger RNA，mRNA）或蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響乳腺癌的進(jìn)展[3]。SBF2 反 義RNA1（SBF2 antisense RNA 1，SBF2-AS1）是一種新的lncRNA，SET結(jié)合因子2（set binding factor 2，SBF2）的反義RNA1，干擾SBF2-AS1可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖[4]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌患者死亡的重要原因之一，而miRNA的異常表達(dá)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移及血管形成等密切相關(guān)[5]。生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SBF2-AS1 與miR-582-5p 有結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道，miR-582-5p可抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[6]，但miR-582-5p 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究旨在研究lncRNA SBF2-AS1 對(duì)乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR-3、MDAMB-231和正常乳腺細(xì)胞MCF10A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司；Transwell 小室、基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD 公司；MTT 試劑盒、RIPA 蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231 和正常乳腺細(xì)胞MCF10A 用RPMI-1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌細(xì)胞MCF-7，分別將miR-582-5p模擬物及陰性對(duì)照（NC）、SBF2-AS1 干擾表達(dá)載體（siRNA）及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞，記為miR-582-5p組、miR-NC組、si-SBF2-AS1 組、si-NC 組；將SBF2-AS1 干擾表達(dá)載體分別與miR-582-5p 抑制劑及陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至MCF-7 細(xì)胞，記為si-SBF2-AS1+miR-582-5p組、si-SBF2-AS1+anti-miR-NC組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)miR-582-5p和SBF2-AS1 表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后按試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.4 Western blotting 檢測(cè)蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉，分別加入一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜；加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入MTT 溶液，孵育4 h，加入二甲基亞砜，反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（OD）值。

1.6 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 各組MCF-7細(xì)胞消化后用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓12 h；遷移實(shí)驗(yàn)：取200 μL MCF-7細(xì)胞懸液于Transwell上室，常規(guī)培養(yǎng)24 h后用0.1%結(jié)晶紫染色液染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell上室加入基質(zhì)膠，其余同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建含有miR-582-5p結(jié)合位點(diǎn)的SBF2-AS1野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體，將其分別與miR-NC 或miR-582-5p共轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞，按試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

將si-NC、si-SBF2-AS1、pcDNA、pcDNA-SBF2-AS1 分別轉(zhuǎn)染至MCF-7，用qPCR 檢測(cè)miR-582-5p表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.00 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SBF2-AS1 和miR-582-5p 在乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞中的表達(dá) 與正常乳腺細(xì)胞MCF10A相比，乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR-3、MDAMB-231 中SBF2-AS1 的表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.05）；而miR-582-5p的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），見圖1。

圖1 SBF2-AS1和miR-582-5p在乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 干擾SBF2-AS1 表達(dá)對(duì)MCF-7 細(xì)胞活性的影響 與si-NC組相比，si-SBF2-AS1組MCF-7細(xì)胞中SBF2-AS1 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Cyclin D1表達(dá)水平顯著降低，p21、p27的表達(dá)水平顯著升高，MCF-7細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05），見圖2、表1。

圖2 干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞活性的影響

表1 干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞活性的影響，n=9

表1 干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞活性的影響，n=9

2.3 干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)目的影響 與si-NC組相比，si-SBF2-AS1組MCF-7細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、MMP-14 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，MCF-7細(xì)胞中遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（均P＜0.05），見表2，圖3。

圖3 干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)目的影響

表2 干擾SBF2-AS1 表達(dá)對(duì)MCF-7 細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)目的影響，n=9

表2 干擾SBF2-AS1 表達(dá)對(duì)MCF-7 細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)目的影響，n=9

2.4 miR-582-5p 過表達(dá)對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC 組相比，miR-582-5p 組Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低，p21的表達(dá)水平顯著升高，MCF-7細(xì)胞活性顯著降低，MCF-7 細(xì)胞中遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（均P＜0.05），見圖4，表3。

表3 miR-582-5p過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響，n=9

表3 miR-582-5p過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響，n=9

圖4 miR-582-5p過表達(dá)對(duì)miR-582-5p及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 lncRNA SBF2-AS1 靶向調(diào)控miR-582-5p 的表達(dá) TargetScan 預(yù)測(cè)顯示，SBF2-AS1 與miR-582-5p有結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。WT-SBF2-AS1 與miR-582-5p共轉(zhuǎn)染后MCF-7 細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），見表4。pcDNA-SBF2-AS1 組miR-582-5p 的表達(dá)水平顯著低于pcDNA 組（P＜0.05）；si-SBF2-AS1 組miR-582-5p 的表達(dá)水平顯著高于si-NC 組（均P＜0.05），見圖6。

表4 miR-582-5p 與WT-SBF2-AS1 或MUT-SBF2-AS1 共 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性，n=9

表4 miR-582-5p 與WT-SBF2-AS1 或MUT-SBF2-AS1 共 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性，n=9

圖5 SBF2-AS1的序列中含有與miR-582-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖6 過表達(dá)或干擾SBF2-AS1后miR-582-5p的表達(dá)

2.6 抑制miR-582-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與si-SBF2-AS1+anti-miR-NC組相比，si-SBF2-AS1+antimiR-582-5p組Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著升高，p21的表達(dá)水平顯著降低，MCF-7細(xì)胞活性顯著升高，MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高（均P＜0.05），見圖7、表5。

表5 抑制miR-582-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，n=9

表5 抑制miR-582-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，n=9

與si-NC組比較，*P＜0.05；與si-SBF2-AS1+anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

圖7 抑制miR-582-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾SBF2-AS1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

3 討論

癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散并擴(kuò)散到身體的遠(yuǎn)處部位是轉(zhuǎn)移性癌癥患者死亡的主要原因，研究乳腺癌的分子機(jī)制，以期為進(jìn)一步研發(fā)有效的靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 和miRNA 均參與調(diào)控乳腺癌的進(jìn)展，可作為其治療的靶點(diǎn)[8-9]。研究報(bào)道，沉默SBF2-AS1 可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲[10]。SBF2-AS1 在肝細(xì)胞癌組織中顯著上調(diào)表達(dá)，敲除SBF2-AS1 通過調(diào)節(jié)miR-140-5p/TGFBR1 抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]。下調(diào)SBF2-AS1 表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[12]。以上研究表明，SBF2-AS1在多種腫瘤中起促癌作用，下調(diào)SBF2-AS1 具有抑制腫瘤進(jìn)展的作用。而SBF2-AS1在乳腺癌中的作用及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)先檢測(cè)了不同乳腺癌細(xì)胞系中SBF2-AS1 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SBF2-AS1在乳腺癌細(xì)胞系中均高表達(dá)，且在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)水平最高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此細(xì)胞（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步干擾SBF2-AS1 表達(dá)后，MCF-7 細(xì)胞活性顯著降低，MCF-7 細(xì)胞中遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（均P＜0.05），說明干擾SBF2-AS1 表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 增殖、遷移和侵襲。提示SBF2-AS1在乳腺癌中也起促癌作用，下調(diào)其表達(dá)可抑制乳腺癌的進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-582-5p 參與多種癌癥的進(jìn)展，如上調(diào)miR-582-5p抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]；過表達(dá)miR-582-5p 通過下調(diào)NOTCH1 抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[14]。此外，miR-582-5p在子宮內(nèi)膜癌、胃癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-582-5p表達(dá)通過靶向AKT3來(lái)抑制人子宮內(nèi)膜癌、胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15-16]。miR-582-5p 還通過靶向Rab27a 抑制人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和侵襲[17]。以上研究表明，miR-582-5p在多種腫瘤中起抑癌作用，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同乳腺癌細(xì)胞系中miR-582-5p 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-582-5p在乳腺癌細(xì)胞系中同樣低表達(dá)，且過表達(dá)miR-582-5p后，MCF-7細(xì)胞活性顯著降低，MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（均P＜0.05），說明過表達(dá)miR-582-5p可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。提示miR-582-5p 在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，與在其他癌癥中的作用相似。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，SBF2-AS1 可靶向調(diào)控miR-582-5p的表達(dá)，而抑制miR-582-5p 表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)干擾SBF2-AS1 表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用（均P＜0.05）。以上結(jié)果提示，SBF2-AS1可能通過調(diào)控miR-582-5p影響乳腺癌進(jìn)展。

綜上所述，干擾lncRNA SBF2-AS1可通過調(diào)控miR-582-5 抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。