劉 奕，劉 靜#，楊若妤#，謝彬彬，黃光瑜，劉鳳玲，連慧琳，熊 灝，曾麒燕,3△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，南寧 530021；2.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)技系，南寧 530021；3.廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,也是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。乳腺癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、生物靶向治療等多種輔助治療為一體的治療方式[2]。治療方案的進(jìn)步使乳腺癌患者的總體5年生存率得到明顯的提高，然而，對于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移乳腺癌患者來說，5 年生存率僅有24.3%[3]。此外，長期用藥引起的耐藥性仍然是乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要因素，大多數(shù)晚期乳腺癌患者不可避免地會產(chǎn)生耐藥性[4]。近年來，作為細(xì)胞交流聯(lián)系的載體—外泌體（Exosomes），被認(rèn)為參與腫瘤化療的耐藥形成過程[5]。有學(xué)者認(rèn)為，外泌體可能通過在腫瘤基質(zhì)和耐藥細(xì)胞、耐藥細(xì)胞和非耐藥細(xì)胞間傳遞各種耐藥相關(guān)因子，改變腫瘤微環(huán)境來促進(jìn)腫瘤耐藥的發(fā)生，但其分子機(jī)制仍不清楚。

外泌體是由細(xì)胞主動(dòng)分泌的擁有脂質(zhì)雙分子層的直徑約為30～100 nm 的納米級囊泡小體。外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊重要的工具，可攜帶多種細(xì)胞調(diào)節(jié)性RNA，包括miRNA、sncRNA 和siRNA，通過轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)吞進(jìn)入靶細(xì)胞，參與細(xì)胞間信息交流，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，并且廣泛參與腫瘤新生血管形成、侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等過程[6]。諸多體內(nèi)、外研究表明，外泌體能抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。Milman 等[8]還發(fā)現(xiàn)外泌體可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性，并介導(dǎo)靶細(xì)胞自分泌和旁分泌信號傳導(dǎo)。Romagnoli 等[9]發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞來源的外泌體能增強(qiáng)激活T 細(xì)胞以獲得更有效免疫應(yīng)答的能力。相反，也有研究表明外泌體能促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展以及導(dǎo)致化療耐藥的產(chǎn)生[10]。乳腺癌患者血清來源外泌體對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展還尚未完全明確。本研究將分析乳腺癌血清來源外泌體對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、耐藥的影響，以期為乳腺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 購自中國科學(xué)院上海分院。

1.1.2 主要試劑與耗材

總RNA 提取試劑盒購自O(shè)mega 公司；柏精超微量核酸蛋白分析儀購自上海漾盟儀器有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒、TB GreenTM Premix ExTaqTM 試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自TaKaRa 公司。DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），胎牛血清（美國GIBCO 公司），CCK8（東仁化學(xué)科技有限公司），F(xiàn)ITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD Pharmingen），6孔板和96孔板（CORNING公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的乳腺癌患者血清標(biāo)本（療效良好6例和耐藥患者3例，下文所謂外泌體，若沒標(biāo)注耐藥患者，均來自療效良好的乳腺癌患者），所有樣本采集均征得患者及其家屬知情同意，且經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 外泌體的提取

將6 mL血清以500 g離心10 min，棄沉淀，于上清液中加入PBS 緩沖溶液至12 mL，2 000 g 離心30 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃，20 000 g離心30 min。繼續(xù)將上清液至另一離心管，4 ℃，110 000 g 下再次離心80 min。棄去上清液，加9 mL PBS 緩沖溶液緩慢重懸沉淀，并用用0.22 μm濾器過濾除菌，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 外泌體的鑒定

1.2.3.1 透射電子顯微鏡觀察 取10 μL 外泌體懸液，滴于電鏡銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min，用乙酸鈾酰負(fù)染15 s，置于濾紙上晾干，用透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)和大小。

1.2.3.2 外泌體的粒徑分析 用1 mL PBS 緩沖溶液重懸外泌體，將懸液注入樣品池，用ZETASIZER Nano series-Nano-ZS粒徑檢測儀檢測外泌體的粒徑大小。

1.2.3.3 流式細(xì)胞術(shù) 用PBS 緩沖溶液重懸外泌體，分別進(jìn)行CD63 抗體和CD81 抗體染色，用流式細(xì)胞儀檢測外泌體的表面標(biāo)志CD63 和CD81 的表達(dá)情況。

1.2.3.4 蛋白印跡法 在外泌體中預(yù)先加入蛋白酶抑制劑（100×苯甲基磺酰氟），100×cocktail和磷酸酶抑制劑，后取 50 μL 外泌體加入等量裂解液在冰上裂解15 min，4 ℃，13 000 g，離心10 min 后取上清，利用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，同時(shí)將上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、抗體孵育和顯色，最后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察CD9、TSG101和HSC70的表達(dá)情況。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞株MCF-7用含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.5 增殖實(shí)驗(yàn)

將MCF-7細(xì)胞以5×103/孔接種于96 孔板，以未處理MCF-7 細(xì)胞為對照組，實(shí)驗(yàn)組加入外泌體（終濃度為20 μg/mL,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2 h 后，檢測OD450nm，以此反映細(xì)胞增殖能力。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

將MCF-7 細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 孔板，以未處理MCF-7 細(xì)胞為對照組，實(shí)驗(yàn)組加入外泌體（終濃度為20 μg/mL,培養(yǎng)24 h 后，用小槍頭在孔中劃線，保持劃法一致均勻。PBS洗去脫落細(xì)胞后，加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 或48 h 后拍照，并用Image J 軟件分析劃痕愈合距離。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)

收集與外泌體共孵育48 h 后的細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌后，加入Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）（0.5 μg/mL），15 min后，加入碘化丙啶（5 μg/mL），上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，以未處理MCF-7細(xì)胞為對照組。

1.2.8 藥物敏感性分析

將MCF-7 細(xì)胞以5×103/孔接種于96 孔板，以Taxo或阿霉素單純用藥組為對照組，實(shí)驗(yàn)組加入外泌體（終濃度為20 μg/mL）,培養(yǎng)24 h后，加入阿霉素（Adriamycin,Adr，0.4 μg/mL）或Taxol（10 μg/mL），培養(yǎng)一定時(shí)間后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2 h 后，檢測OD450nm，并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定

外泌體在透射電子顯微鏡下顯示呈茶托狀，直徑約70 nm（圖1A）；粒徑分析結(jié)果顯示，樣本平均粒徑為為38.17 nm，分布系數(shù)為0.477 PDI，粒徑主峰為71.26 nm，粒徑20～200 nm，百分比為76.2%（圖1B）；流式細(xì)胞術(shù)檢測CD63 陽性率為77.4%，CD81 陽性率為91.8%（圖2A）；蛋白質(zhì)印跡法可檢測到CD9、TSG101及HSC70的表達(dá)條帶（圖2B）。

圖1 血清外泌體形態(tài)觀察及粒徑分析

圖2 血清外泌體特異性蛋白標(biāo)志物的檢測

2.2 乳腺癌患者血清來源的外泌體抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的MCF-7 細(xì)胞A450值明顯降低（P＜0.05），表明外泌體明顯抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖能力（圖3）。

圖3 血清外泌體可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖

2.3 乳腺癌患者血清來源的外泌體抑制MCF-7 細(xì)胞的遷移

實(shí)驗(yàn)組的MCF-7 細(xì)胞的24 h 和48 h 的劃痕愈合率分別為（17.78 ± 2.35）%和（34.88 ± 3.12）%，而對照組24 h和48 h劃痕愈合率分別為（27.51±3.02）%和（46.7±7.25）%，兩組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的愈合率明顯降低（P＜0.01，P＜0.001），提示外泌體可抑制MCF7細(xì)胞的遷移能力，見圖4。

圖4 血清外泌體可抑制MCF-7細(xì)胞的遷移

2.4 乳腺癌患者血清來源的外泌體誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡

對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡比例分別為5.53%和10.03%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05），提示外泌體可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，見圖5。

圖5 血清外泌體可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡

2.5 乳腺癌患者血清來源的外泌體增強(qiáng)MCF-7 細(xì)胞對阿霉素的敏感性

如圖6A所示，單純阿霉素（Adr）處理組的細(xì)胞增殖抑制率為48.5%，當(dāng)阿霉素分別與來自3 位療效良好的乳腺癌患者血清的外泌體共同作用（Adr+Exo）后，增殖抑制率分別為87.9%、90.5%和88.9%，與單純阿霉素處理組相比，抑制效果明顯升高（P＜0.01）。同時(shí)將外泌體與Taxol共同作用（Tax+Exo），發(fā)現(xiàn)抑制效果并沒有明顯提高（見圖6B）。從3 位耐藥患者血清中分離出外泌體（Exo耐），發(fā)現(xiàn)與單純阿霉素處理組相比，Exo耐與阿霉素聯(lián)合作用（Adr+Exo耐）可明顯降低細(xì)胞增殖的抑制率（P＜0.01，圖6A）；類似地，與單純Taxol處理組相比，Exo耐與Taxol 聯(lián)合作用（Adr+Exo耐）也可明顯降低細(xì)胞增殖的抑制率（P＜0.05，圖6B）。從健康人血清中分離的外泌體（Exo健康）與阿霉素或Taxol 聯(lián)合作用與單純化療藥處理相比，抑制率無明顯變化（均P＞0.05）（圖6A和圖6B）。

圖6 血清外泌體影響MCF-7細(xì)胞對化療藥的敏感性

3 討論

外泌體的分離方法包括超速離心法、密度梯度離心法、聚乙二醇沉淀法、免疫磁珠分離法等。超速離心法是目前認(rèn)為分離外泌體的經(jīng)典方法，操作簡單，但需要樣本量較大且得率較少；密度梯度離心法需要控制合適的離心時(shí)間，否則相似密度的污染顆粒可混在外泌體中；聚乙二醇沉淀法存在非囊泡污染物（如脂蛋白），而且聚乙二醇混雜可能會影響下游分析；免疫磁珠分離法不適合從大量樣本中分離外泌體。王婷婷等[11]發(fā)現(xiàn)，血清較血漿中外泌體數(shù)量略高，故本研究選擇超速離心法分離血清外泌體。目前對于外泌體的鑒定主要有透射電鏡觀察形態(tài)、粒徑分析、免疫印跡或流式分析特異蛋白等。本研究中，透射電鏡觀察到的外泌體大小與粒徑測定結(jié)果相符，約100 nm 左右，外泌體形態(tài)呈茶托狀，具有雙層膜包裹的囊性結(jié)構(gòu)，這與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致。外泌體特異性表達(dá)CD9、CD63、CD81、CD82、Alix、TSG101、HSC70等分子，本研究選擇了CD9、CD63、CD81、TSG101 和HSC70 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，它們在外泌體樣本中的表達(dá)豐度較高，說明所提外泌體符合要求且純度較高，能滿足后續(xù)研究的要求。

目前研究認(rèn)為外泌體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)主要有以下3 種途徑：通過受體與靶細(xì)胞相互作用、直接與靶細(xì)胞無選擇性融合以及靶細(xì)胞的內(nèi)吞作用。外泌體通過將其內(nèi)含物傳遞到靶細(xì)胞，影響細(xì)胞內(nèi)各種生理病理過程，如調(diào)控炎癥[13]、跨越血腦屏障[14]、血管生成[15]、腫瘤形成、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞通過外泌體雙調(diào)蛋白(AREG)與細(xì)胞表面表皮生長因子受體結(jié)合，可活化EGFR 通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡。Sun等[18]報(bào)道荷瘤小鼠的骨髓來源樹突狀細(xì)胞的外泌體通過PD-L1 抑制自身CD8+T 細(xì)胞的增殖和活化，導(dǎo)致免疫耐受并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Yang等[19]研究表明，乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體通過miR-146a/TXNIP軸激活Wnt通路，促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，進(jìn)而促進(jìn)上皮間轉(zhuǎn)化和乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Kannan 等[20]發(fā)現(xiàn)，外泌體中的SH3GL2 和MFN2 對乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為可能具有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，從治療效果良好的乳腺癌患者血清中分離的外泌體可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移，并誘導(dǎo)凋亡，但其分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

腫瘤微環(huán)境在調(diào)控腫瘤細(xì)胞對藥物敏感性方面發(fā)揮著重要作用。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）作為乳腺癌微環(huán)境中主要的基質(zhì)細(xì)胞，CAFs 與腫瘤細(xì)胞密切接觸，且存在大量的動(dòng)態(tài)信息交互，可通過分泌細(xì)胞因子、外泌體等方式影響乳腺癌的療效。在乳腺癌中，外泌體microRNAs 如miR-21、miR-30c、miR-222、miR-451、miR-489、miR-155已被證實(shí)參與耐藥形成[21]，但具體機(jī)制尚不明確。乳腺癌耐藥細(xì)胞來源的外泌體高表達(dá)UCH-L1 蛋白和miR-221-3p，可激活MAPK／ERK 信號通路上調(diào)PgP 蛋白的表達(dá)或PI3K/AKT 信號通路，從而向受體細(xì)胞傳遞耐藥性[22]。本研究從治療效果良好的乳腺癌患者血清中分離的外泌體可增加乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性，但對Taxol的敏感性無影響，相反從乳腺癌耐藥患者血清中分離的外泌體則降低乳腺癌細(xì)胞對阿霉素和Taxol 的敏感性，提示來自不同療效的患者血清外泌體對于乳腺癌對化療藥敏感性的效果是不同的，其中可能涉及不同療效患者外泌體中的不同RNA 和蛋白質(zhì)所介導(dǎo)的不同信號通路，因而在后續(xù)的研究中有必要對療效良好患者和耐藥患者的外泌體進(jìn)一步鑒定其中的差異RNA和蛋白質(zhì)，以探明乳腺癌的耐藥機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥提供基礎(chǔ)。

綜上所述，通過對乳腺癌患者血清來源的外泌體進(jìn)行提取和鑒定，結(jié)果表明，這些外泌體可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡以及對化療藥的敏感性，但其中的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。