石倩倩，敖青青，韋蘭成，郭松超,，唐 深，李習藝，歐陽軼強，陸彩玲△

（廣西醫(yī)科大學 1.公共衛(wèi)生學院；2.基礎醫(yī)學院；3.實驗動物中心，南寧 530021）

乳腺癌是一類常見嚴重危害女性健康的高度異質性腫瘤，是女性癌癥死亡的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，我國乳腺癌發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已居女性惡性腫瘤發(fā)病的首位，且發(fā)病越來越年輕化[1-2]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受諸多因素影響。建立適宜的乳腺癌動物模型，有助于整體研究乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，對乳腺癌的防治具有重要意義。樹鼩是一種新興的實驗動物，其全基因組測序結果與靈長類動物具有高度同源性，在諸多方面（如：生理代謝、免疫、遺傳等）與人類具有較高的相似性[3]。近年來，樹鼩廣泛的應用于乳腺癌動物模型，并取得一定的進展[4-5]。代謝組學是對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關系的研究方法。大量的研究顯示，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，機體的代謝也隨著發(fā)生變化，這些代謝物質可以成為新潛在的篩查和診斷乳腺癌的方法標志物[6-7]。但近年來，在乳腺癌的研究中，以樹鼩為動物模型且運用代謝組學技術分析的研究卻鮮有報道。因而，在本研究中，我們通過構建樹鼩乳腺癌模型，采用GC-TOFMS 技術，檢測自發(fā)乳腺癌樹鼩血清代謝物的變化，從代謝組學角度闡述其代謝產物的變化特征，為進一步探究乳腺癌發(fā)病的潛在生物標志物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雌性樹鼩（4 月齡及以上）50只，健康未育，體重（130±10）g，由中國科學院昆明動物研究所提供（實驗動物生產許可證：SCXK（滇）K2016-0002）。飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學普通級動物飼養(yǎng)室（實驗動使用許可證：SYXK 桂2020-0004），喂飼樹鼩專用的全價飼料，自由飲水。飼養(yǎng)室保持溫度20～25 ℃，濕度30%～60%，每日清潔2次。實驗動物的處理方法均經廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準（批準文號:201804054）。

1.2 主要試劑 甲醇（CNW Technologies，德國），氯仿及吡啶（上海阿達瑪斯有限公司），L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司），飽和脂肪酸甲酯（Dr.Ehrenstorfer，德國）。

1.3 樣本采集與制備 觀察記錄各組樹鼩的體重及體長等基礎信息，實驗觀察期限為24個月。實驗觀察期限結束后，從自發(fā)發(fā)生乳腺癌的樹鼩中選取7 例病理組織學鑒定確診為乳腺癌的為模型組（T組），同時選取12 例為未發(fā)生乳腺癌的健康樹鼩為對照組（C 組）。對樹鼩進行采血1～1.5 mL 放入無抗凝劑離心管中，放置4 ℃冰箱2 h，4 ℃離心取上層血清分裝于1.5 mL 離心管中，放置-80 ℃超低溫冰箱保存待檢。

1.4 血清代謝組學分析

1.4.1 樣品前處理 血清樣本解凍后，取樣本50 μL于1.5 mL EP管中，加入200 μL預冷提取液甲醇，再加入5 μL L-2-氯苯丙氨酸，渦旋30 s 后超聲10 min（冰水?。粚⑵浞湃? ℃離心機離心（12 000 rpm/15 min）；隨后小心移取上清液于EP 管中并在真空濃縮器中干燥（每個樣本各取30 μL混合成QC樣本）；后加入30 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min；加入40 μL BSTFA（含有1% TMCS，v/v），將混合物70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL FAMEs（溶于氯仿）；隨機順序上機檢測。

1.4.2 儀器設置和進樣分析 使用氣相色譜儀—飛行時間質譜儀對樣本進行檢測分析。具體參數(shù)如下：系統(tǒng)色譜柱采用DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）自動進樣，進樣體積為1 μL。以氦氣作為載氣，前部入口吹掃流量為3 mL min-1，通過色譜柱的氣體流速為1 mL min-1。初始溫度保持在50 ℃下1 min，再以20 ℃min-1的速率升至310℃，最后在310℃下保持6 min。質譜接口、傳輸線和離子源溫度分別為280 ℃、280 ℃和250 ℃。采用EI 源，碰撞電壓設置為70 eV質譜，全掃描模式（M/Z 50-500），掃描速度為12.5 spectra/s。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。代謝組學數(shù)據(jù)使用SIMCA軟件（V15.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden）進行分析。檢測所得的代謝物采用正交偏最小二乘法—判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA）；差異代謝物篩選卡值標準為t檢驗的P值＜0.05，同時OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）＞1。使用京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、MetaboAnalyst分析出相應的代謝通路。

2 結果

2.1 樹鼩的基本情況 到觀察結束時，C組樹鼩體重為（123.65±10.54）g，體長為（17.73±0.65）cm；T 組樹鼩體重為（118.6±19.44）g，體長為（17.07±0.19）cm，腫瘤質量為（0.75±0.66）g。

2.2 各組樹鼩總離子流圖 通過GC-TOFMS分析研究兩組間血清樣品的代謝物圖譜，從血清樣本中提取了493 個峰，經過進一步的處理，最后確定了451 個特征峰。如圖1 所示，可看出樣品出峰均勻，強度適中，適宜T組與C組的血清樣品分析。在色譜質譜聯(lián)用儀檢測中，QC 樣本可用于評價其系統(tǒng)的穩(wěn)定性，QC 樣本相關性越接近于1（應≥0.7），表明模型穩(wěn)定性越好數(shù)據(jù)質量越高，見圖2。

圖1 兩組樹鼩血清的總離子流圖

圖2 QC樣本相關性分析圖

2.3 OPLS-DA 分析 OPLS-DA 得分圖（圖3A）說明，兩組血清樣本區(qū)分非常顯著，且?guī)缀跆幱?5%置信區(qū)間內。置換檢驗結果（圖3B）說明構建的OPLS-DA模型符合真實情況，無擬合過度現(xiàn)象。

圖3 OPLS-DA得分圖和OPLS-DA模型的置換檢驗結果圖

2.4 差異代謝物的篩選 通過SIMCA-V15.0.2 進行分析，以OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（VIP）＞1 及P＜0.05，篩選出的結果見圖4A。通過對篩選出的差異代謝物進行定性，共定性到32種差異代謝物，其中14種已知（表1）。與正常對照組相比，自發(fā)乳腺癌組中有13種下調，1種上調（圖4B）。

表1 樹鼩自發(fā)乳腺癌關鍵差異代謝產物

圖4 差異代謝物篩選火山圖和層次聚類分析結果熱力圖

2.5 差異代謝物的代謝通路分析 對篩選出的14種差異代謝物經MetaboAnalyst通路富集分析，確定正常對照組與自發(fā)乳腺癌組的差異代謝物相關的生物學途徑（圖5），通路影響值提示，精氨酸和脯氨酸代謝、花生四烯酸代謝通路與樹鼩自發(fā)乳腺癌代謝調節(jié)的作用機制密切相關。對上述代謝物參與的代謝途徑進行整合分析，通過KEGG數(shù)據(jù)庫處理上述代謝的代謝過程，得到4 種標志性差異代謝產物通路，歸屬結果見表2。

圖5 代謝通路氣泡圖

表2 4種差異代謝產物代謝通路歸屬

3 討論

本研究對19 只納入時體重及體長等無差別的樹鼩進行了24個月的觀察，至觀察結束，7只樹鼩先后自發(fā)了乳腺癌。進一步地，采用GC-TOFMS比較了正常樹鼩與自發(fā)乳腺癌樹鼩中血清代謝物的差異，通過生物信息學技術分析差異代謝物，確定血清中脯氨酸、羥脯氨酸、肌酸以及花生四烯酸存在差異，極有可能參與樹鼩乳腺癌的自發(fā)過程。

脯氨酸為環(huán)狀α-亞氨基酸，是合成人體蛋白質的重要氨基酸之一。其在蛋白合成、機體的新陳代謝、抗氧化及免疫反應等方面發(fā)揮著重要的調控作用。羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）是一種非必需氨基酸，主要存在于膠原組織中，是構成膠原的重要成分之一，可由脯氨酸轉變而成。羥脯氨酸作為膠原蛋白中的特異性氨基酸，可以反映機體中膠原蛋白含量的變化，而膠原蛋白含量變化又與許多疾病有關（如燒傷、肝硬化、腫瘤等）。腫瘤細胞快速增殖往往需要大量的氨基酸，并以此維持旺盛的蛋白合成和能量供給[8]。本研究乳腺癌組血清中的脯氨酸及羥脯氨酸水平低于正常組，可能是乳腺癌細胞代謝旺盛，攝取并消耗機體脯氨酸及羥脯氨酸致血清中的豐度降低。與人類乳腺癌研究中也有脯氨酸及羥脯氨酸下降的報道一致[9]。

肌酸是一種含氮的有機酸，可快速為細胞提供能量。隨著腫瘤的生長，腫瘤體積增加，癌細胞快速無限增殖，所需的能量也隨著增加，需要大量的三磷酸腺苷（ATP）參與。但在機體內ATP的存儲量較少，且合成速度較慢。本實驗乳腺癌組組中肌酸含量出現(xiàn)顯著下調，可能是癌細胞的增殖需要消耗大量的肌酸以合成ATP。在人乳腺癌患者血漿代謝組學中，肌酸在癌癥患者血漿中也表現(xiàn)為降低[8]。同時，在患乳腺癌貓血清的代謝組學研究中，也有肌酸降低的報道[10]。

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是n-6 系列多不飽和脂肪酸中重要的脂肪酸，對哺乳動物而言是必需的?；ㄉ南┧嵩谏矬w內主要是以磷脂的形式存在于細胞膜上，在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下分解釋放為游離的AA，且轉變?yōu)榫哂猩锘钚缘拇x產物，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9]。本研究結果顯示，相較于對照組，自發(fā)乳腺癌組中的花生四烯酸水平明顯降低，與文獻報道一致[11]。AA能刺激鞘磷脂轉變?yōu)樯窠涻０?，誘導細胞凋亡，從而達到抑制腫瘤生長的目的[12]。本研究中乳腺癌組的花生四烯酸含量低于正常組，可能有助于腫瘤細胞生長。

綜上所述，脯氨酸、羥基脯氨酸、花生四烯酸和肌酸的改變與樹鼩自發(fā)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關。這些差異代謝物表明，樹鼩乳腺癌發(fā)生過程中，機體代謝變化涉及了花生四烯酸及精氨酸、脯氨酸代謝途徑。差異代謝物在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的確切機制有待進一步探索。