張艷艷 王冰蕊 丁江濤 劉興麗 王宏偉 張 華

(鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心；河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

冷凍面團(tuán)技術(shù)不僅可以有效地提高冷凍面制品的標(biāo)準(zhǔn)化，還能滿足人們對(duì)食品新鮮度的高要求[1]。然而常規(guī)的冷凍方式在冷凍過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生較大冰晶，破壞面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致面團(tuán)持氣性下降，從而引起面制品的品質(zhì)劣變，如體積變小、黏彈性降低、蒸煮后口感差、褐變、微生物超標(biāo)等問(wèn)題[2,3]。因此，探究改善冷凍面制品品質(zhì)的方法，具有極其重要的意義。靜電場(chǎng)是一種新型的非熱技術(shù)，具有設(shè)備成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。其作用機(jī)制是在低溫環(huán)境下，通過(guò)電場(chǎng)擾動(dòng)形成均勻的細(xì)小冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞[4]。在無(wú)靜電場(chǎng)作用下，由于水分子的偶極矩方向是任意的，冰晶在不同方向上生長(zhǎng)的概率相同。施加靜電場(chǎng)后，沿靜電場(chǎng)方向冰核形成的概率最大，且冰晶生長(zhǎng)主要沿電場(chǎng)方向進(jìn)行(圖1)，其他方向分布的水分子需要克服較大的位阻實(shí)現(xiàn)液-固的轉(zhuǎn)變，因此起到抑制冰晶生長(zhǎng)的作用，降低冰晶的生長(zhǎng)速率[5]。

圖1 靜電場(chǎng)的作用機(jī)制圖

高文宏[6]研究發(fā)現(xiàn)靜電場(chǎng)對(duì)葡萄糖和蔗糖溶液中冰晶的生長(zhǎng)都有不同程度的抑制作用，使得相變時(shí)間有所延長(zhǎng)，在電場(chǎng)輔助冷凍過(guò)程中對(duì)食品產(chǎn)生積極影響，有利于維持食品較高的品質(zhì)特征。尚柯等[7]研究發(fā)現(xiàn)，靜電場(chǎng)輔助凍結(jié)牛肉能顯著縮短肉樣通過(guò)最大冰晶生成帶所用的時(shí)間，冰晶的體積小且均勻。Xanthakis等[8]研究靜電場(chǎng)輔助冷凍對(duì)豬肉的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜電場(chǎng)輔助冷凍下形成冰晶的尺寸顯著減小，從而降低了對(duì)肉樣微觀結(jié)構(gòu)的損害。

小麥面筋蛋白在面團(tuán)強(qiáng)度、延展性和氣體滯留性方面起著決定性作用，其性能與面團(tuán)的最終食用品質(zhì)密切相關(guān)，因此，冷凍過(guò)程中面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞，是影響面團(tuán)品質(zhì)劣變的主要原因之一[9]。本實(shí)驗(yàn)將低頻交變電場(chǎng)施加到濕面筋蛋白體系的冷凍過(guò)程，研究其對(duì)面筋蛋白流變特性、水分分布和熱力學(xué)特性的影響；在分子水平上探究靜電場(chǎng)對(duì)面筋蛋白品質(zhì)的改善作用，并采用激光顯微共焦拉曼光譜儀對(duì)其分子結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行原位分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉(蛋白質(zhì)11.10%，含水量11.34%)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、5,5′-二硫代雙-2-硝基苯酸(DTNB)、尿素、牛血清蛋白、Folin-酚試劑等：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJJM54S 面筋洗滌儀，Discovery旋轉(zhuǎn)流動(dòng)儀，DSC-Q20差式掃描量熱儀，HWS-080恒溫恒濕醒發(fā)箱，NMI-20低場(chǎng)核磁共振成像分析儀，LGL-50FD冷凍干燥機(jī)，TU-1810 PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，inVia激光顯微共焦拉曼光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 電場(chǎng)輔助冷凍面筋蛋白

參考趙雷[10]面筋蛋白的提取方法并略有修改。準(zhǔn)確稱取10 g小麥粉，緩慢倒入面筋洗滌杯中，加入4.5 mL質(zhì)量濃度為2%的NaCl溶液，設(shè)置和面時(shí)間40 s，先用2%NaCl溶液洗滌3 min，再用蒸餾水洗滌2 min。洗滌完成后取出面筋蛋白，每個(gè)面筋蛋白樣品取3.5 g放入自封袋中備用。

將制備好的面筋蛋白置于溫度為-18 ℃、型號(hào)相同且放在同一環(huán)境下的施加電場(chǎng)和未施加電場(chǎng)的冰箱中冷凍，電場(chǎng)電壓分別為300、600、900 V，使用多路溫度測(cè)定儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)樣品中心溫度，當(dāng)樣品中心溫度達(dá)到-18 ℃并穩(wěn)定60 min時(shí)，取出樣品。取部分樣品置于30 ℃的恒溫恒濕箱解凍30 min后用于直接測(cè)定水分分布和流變特性，剩余樣品冷凍干燥后研磨，過(guò)100目篩，得到小麥干面筋蛋白粉。

注：1.靜電場(chǎng)總電源，2.電冰箱，3.電場(chǎng)板，4.置物架，5.面筋蛋白。圖2 靜電場(chǎng)輔助冷凍面筋蛋白裝置圖

1.3.2 面筋蛋白流變學(xué)特性的測(cè)定

根據(jù)王沛[11]的方法并稍作改動(dòng)。將不同強(qiáng)度下電場(chǎng)輔助冷凍的面筋蛋白解凍后，放置在旋轉(zhuǎn)流變儀的底板上，進(jìn)行面筋蛋白流變學(xué)特性的測(cè)定。

1.3.3 面筋蛋白熱特性的測(cè)定

根據(jù)Huang等[12]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取2～3 mg凍干面筋蛋白樣品，密封好加入DSC小鋁鍋中。以5 ℃/min的速度從25 ℃升到100 ℃。變性峰值溫度(Tp)和焓值(ΔH)采用TA系統(tǒng)中的Muse軟件分析計(jì)算。

1.3.4 面筋蛋白化學(xué)作用力的測(cè)定

參考Wang等[13]、Li等[14]、冷利萍[15]的方法，并稍作改動(dòng)。取0.2 g凍干的面筋蛋白粉末分別與10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、 0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)以及0.6 mol/L NaCl+8mol/L尿素+1.5 mol/L尿素(SE)溶液混合，并在1 600 r/min離心均質(zhì)15 s后，在4 ℃的條件下靜置1 h，于8 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定其吸光度。用Folin-酚法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵的貢獻(xiàn)分別以溶解于SB溶液與SA溶液、SC溶液與SB溶液、SD溶液與SC溶液、SE溶液與SD溶液中蛋白質(zhì)含量之差表示。

1.3.5 面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)的分析

采用激光顯微共焦拉曼光譜儀對(duì)面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、二硫鍵構(gòu)型等分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行原位分析。將冷凍干燥后的面筋蛋白，切成適當(dāng)大小的方塊后，置于載玻片上，用激光顯微共焦拉曼光譜儀進(jìn)行成像。成像參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)785 nm，掃描面積1 000 μm ×1 000 μm，步長(zhǎng)4 μm。對(duì)采集到的拉曼光譜的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(1 600～1 700 cm-1)和二硫鍵構(gòu)型(500～550 cm-1)譜帶區(qū)間進(jìn)行分析成像。

1.3.6 面筋蛋白的掃描電子顯微鏡觀察

將冷凍干燥后的面筋蛋白，切成適當(dāng)大小的方塊后，噴金后貼于置物臺(tái)上，用掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜電場(chǎng)輔助冷凍對(duì)面筋蛋白流變特性的影響

由圖3可知，當(dāng)電壓強(qiáng)度為300～600 V時(shí)，彈性模量和黏性模量呈增加趨勢(shì)，而當(dāng)電壓強(qiáng)度為600～900 V時(shí)，G′、G″又開(kāi)始降低。這可能是因?yàn)榈蛷?qiáng)度電壓輔助冷凍處理后，可減少由于冰晶損傷所引起的非共價(jià)鍵的斷裂，且能減少大分子蛋白質(zhì)聚合物的結(jié)構(gòu)損傷，而高強(qiáng)度的電壓會(huì)損害面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。損耗角正切值tanδ=G′′/G′，彈性模量均大于黏性模量(tanδ 值小于1)，表明面筋蛋白復(fù)合體系介于黏性液體與彈性固體之間，具有類(lèi)固體特性。在不同的電場(chǎng)強(qiáng)度下，面筋蛋白的tanδ 呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)靜電場(chǎng)的強(qiáng)度為600 V時(shí)，tanδ 值達(dá)到最大，這說(shuō)明施加600 V的靜電場(chǎng)對(duì)面筋蛋白彈性的貢獻(xiàn)大于黏性，這有利于谷蛋白分子之間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，能更好地賦予面團(tuán)彈性[16]。

圖3 靜電場(chǎng)輔助冷凍對(duì)面筋蛋白流變特性的影響

2.2 靜電場(chǎng)輔助冷凍對(duì)面筋蛋白熱特性的影響

面筋蛋白的熱力學(xué)性質(zhì)是反映面筋強(qiáng)度的重要特征，熱變性溫度(Tp)和變性焓(ΔH)是評(píng)估面筋蛋白熱穩(wěn)定性的主要參數(shù)[17]。由表1可知，與對(duì)照相比，不同強(qiáng)度下電場(chǎng)輔助冷凍的面筋蛋白樣品的Tp和ΔH均增加。Tp可用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的分子流動(dòng)性和水化程度，當(dāng)某種物質(zhì)解聚時(shí)，其熱變性的溫度將降低，這說(shuō)明施加靜電場(chǎng)后，面筋蛋白的低熱穩(wěn)定性提高，且減緩了冷凍對(duì)面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)的空間結(jié)構(gòu)的破壞[18]。ΔH反映面筋蛋白有序化結(jié)構(gòu)的高低，由表1可以看出，隨著電場(chǎng)電壓的升高，面筋蛋白的ΔH呈先增加后降低的趨勢(shì)，且ΔH分別增加0.088、0.252、0.115 J/g。有研究表明，冷凍后面筋蛋白的ΔH降低，則面筋蛋白的有序結(jié)構(gòu)減少，而施加300 V的靜電場(chǎng)后，面筋蛋白的有序性相對(duì)較高[19]。這可能是靜電場(chǎng)會(huì)抑制水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，從而抑制冰晶的生長(zhǎng)，而當(dāng)電壓過(guò)高時(shí)，又會(huì)對(duì)面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞。

表1 靜電場(chǎng)輔助冷凍對(duì)面筋蛋白熱特性的影響

2.3 靜電場(chǎng)輔助冷凍對(duì)面筋蛋白化學(xué)作用力的影響

維持蛋白質(zhì)三級(jí)網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)作用力有離子鍵、氫鍵、疏水相互作用等，而二硫鍵是穩(wěn)定面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵，麥谷蛋白通過(guò)鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的蛋白骨架，而醇溶蛋白通過(guò)氫鍵和疏水性共價(jià)鍵鑲嵌在麥谷蛋白網(wǎng)絡(luò)中[20]。如圖4所示，與傳統(tǒng)冷凍方式相比，施加靜電場(chǎng)后氫鍵的含量呈先降低后增加的趨勢(shì)，離子鍵、疏水相互作用和二硫鍵的含量則相反。氫鍵含量的減少可能是因?yàn)樵诶鋬鲞^(guò)程中，靜電場(chǎng)會(huì)擾動(dòng)水分子間氫鍵的形成，使冷凍過(guò)程中形成的冰晶較小且分布均勻，進(jìn)而減少冷凍過(guò)程中冰晶對(duì)面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞。疏水相互作用的增加可能是因?yàn)樵陟o電場(chǎng)的作用下，面筋蛋白的疏水性基團(tuán)發(fā)生暴露，促使疏水相互作用增強(qiáng)，而電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)高時(shí)，由于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，更多的疏水性氨基酸暴露，且生成了更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致疏水相互作用減弱[21]。300 V的靜電場(chǎng)處理后，使巰基不斷地暴露和逐漸氧化，因此二硫鍵含量增加，而當(dāng)靜電場(chǎng)電壓增大時(shí)，又會(huì)引起蛋白中二硫鍵的斷裂，從而引起二硫鍵含量的下降。靜電場(chǎng)作用下離子鍵的含量也顯著增加，這表明施加靜電場(chǎng)對(duì)冷凍過(guò)程中離子鍵的含量和疏水相互作用具有一定保護(hù)作用。

圖4 靜電場(chǎng)輔助冷凍對(duì)面筋蛋白化學(xué)作用力的影響

2.4 靜電場(chǎng)輔助冷對(duì)面筋蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響

研究面筋蛋白的2個(gè)主要區(qū)域，分別是1 600～1 700 cm-1(酰胺I帶)和500～550 cm-1(二硫鍵)。酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)是表征蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的一種有效方法。對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的歸屬為：α-螺旋(1 645～1 660 cm-1)，β-轉(zhuǎn)角(1 640～1 645 cm-1、1 680～1 690 cm-1)，無(wú)規(guī)則卷曲(1 660～1 670 cm-1)，β-折疊(1 670～1 680 cm-1)[22]。面筋蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化如圖5所示，在300、600 V的靜電場(chǎng)電壓處理后，面筋蛋白各二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的分布更加均勻，當(dāng)靜電場(chǎng)電壓為300 V時(shí)，α-螺旋的含量增加，這說(shuō)明冷凍過(guò)程中面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增強(qiáng)，而當(dāng)靜電場(chǎng)電壓增加到600 V以后，面筋蛋白中β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量增加，且電壓為900 V時(shí)各二級(jí)結(jié)構(gòu)單元又產(chǎn)生聚集，這是因?yàn)楦哽o電場(chǎng)電壓導(dǎo)致面筋蛋白的結(jié)構(gòu)無(wú)序化。

注：黃色、藍(lán)色為β-轉(zhuǎn)角，紅色為α-螺旋，綠色為無(wú)規(guī)則卷曲，水綠色為β-折疊。圖5 靜電場(chǎng)輔助冷凍面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的共聚焦顯微拉曼圖

在拉曼光譜中，500～550 cm-1是S-S的特征振動(dòng)譜帶，510 cm-1附近的譜峰歸屬于gauche-gauche-gauche(g-g-g)構(gòu)型，536 cm-1附近的譜峰歸屬于trans-gauche-trans(t-g-t)構(gòu)型，其中g(shù)-g-g構(gòu)型是面筋蛋白中最主要的、能量最穩(wěn)定的構(gòu)型[23]。如圖6所示，施加靜電場(chǎng)后面筋蛋白中g(shù)-g-g構(gòu)型含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)靜電場(chǎng)電壓為600 V時(shí)，面筋蛋白中的g-g-g構(gòu)型的含量最多，這說(shuō)明一定強(qiáng)度的靜電場(chǎng)電壓有利于面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

注：紅色為g-g-g構(gòu)型，綠色為t-g-t構(gòu)型。圖6 靜電場(chǎng)輔助冷凍面筋蛋白的二硫鍵構(gòu)型的共聚焦顯微拉曼圖

2.5 靜電場(chǎng)輔助冷凍對(duì)面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖7為面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化。對(duì)照組中面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)疏松，孔洞較大且分布不均勻，而靜電場(chǎng)輔助冷凍處理后的面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較對(duì)照組有所改善，孔徑更小且分布均勻。這是因?yàn)樵陟o電場(chǎng)的作用下，相變初期容易形成冰核，且在冰晶的生長(zhǎng)階段抑制水分子進(jìn)行液—固轉(zhuǎn)變，從而降低冰晶的生長(zhǎng)速度，使得冷凍過(guò)程中冰晶的大小和分布更加均勻，減少了冰晶體積增大對(duì)面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞[24]。

圖7 靜電場(chǎng)輔助冷凍面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響(200×)

3 結(jié)論

研究不同靜電場(chǎng)電壓輔助冷凍對(duì)面筋蛋白品質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明低電壓靜電場(chǎng)輔助冷凍有利于提高面筋蛋白的黏彈性和熱特性?；瘜W(xué)作用力結(jié)果表明，當(dāng)300 V靜電場(chǎng)電壓輔助冷凍面筋蛋白的疏水相互作用和二硫鍵含量增加，且激光共聚焦拉曼圖反映300、600 V的靜電場(chǎng)促進(jìn)面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元分布更加均勻且二硫鍵構(gòu)型中g(shù)-g-g構(gòu)型的含量增加，面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果也進(jìn)一步證明了300、600 V的靜電場(chǎng)電壓對(duì)面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、黏彈性和熱特性的有效改善作用。而靜電場(chǎng)的電壓為900 V時(shí)，過(guò)大的電壓強(qiáng)度會(huì)破壞分子中的二硫鍵，造成面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的塌陷。因此，低電壓的靜電場(chǎng)輔助冷凍處理可以通過(guò)減少冷凍過(guò)程中冰晶的尺寸且使其分布更加均勻，有效地減少冷凍對(duì)面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)的破壞作用。