劉 芳 李萌萌 劉遠曉 劉海波 關(guān)二旗 卞 科

(河南工業(yè)大學糧油食品學院，鄭州 450001)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是由鐮刀菌屬真菌引起的一種病害，赤霉病侵染小麥后，不僅會降低小麥產(chǎn)量，而且會導致小麥中蛋白質(zhì)和面筋含量降低、研磨出粉率降低、面制品的顏色加深，進而影響小麥的理化特性及食用品質(zhì)[1-3]。此外，鐮刀菌侵染小麥后在生長和貯藏過程中會產(chǎn)生多種真菌毒素。其中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的最主要的一種單端孢霉烯族化合物，是小麥中檢出率最高、危害最嚴重的真菌毒素之一[4]。DON可以與核糖體結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)、RNA和DNA的合成，并誘導細胞凋亡，當人和動物攝入DON(超出國家限量標準1 mg/kg) 時，會產(chǎn)生嘔吐、腹瀉、厭食、惡心、神經(jīng)紊亂等中毒反應[5]。長期攝入DON，即使是在較低濃度下，也會損害人和動物的健康，攝入過多時可能使造血系統(tǒng)受到損害從而導致死亡[6]。

食品中真菌毒素的防控可分為產(chǎn)前預防和產(chǎn)后削減兩個途徑。產(chǎn)前預防即在谷物收獲前進行，通常使用殺真菌劑和生物防治劑來進行殺菌，或者在谷物中植入外源性基因以增強谷物的抗逆性[7]。真菌毒素的預防過程可能受到多種因素的影響，例如谷物品種、播種時間、培育技術(shù)以及儲藏方法等，這些因素都會影響谷物中真菌毒素的產(chǎn)生和分布[8]。產(chǎn)后削減方法可分為物理消減、化學降解和生物降解三類，其中物理消減方法主要包括吸附、擠壓蒸煮、熱處理、輻照等；化學降解一般是使用化學制劑脫毒，如碳酸鈉、石灰水、氯氣、氨氣以及臭氧等氣體或水溶液；生物降解可通過微生物代謝、發(fā)酵、添加酶制劑等方法來實現(xiàn)對真菌毒素的降解[9]。

臭氧(Ozone，O3)是一種具有極強氧化性和高效殺菌性的氣體，將其作為一種化學方法來降解DON已成為一種新興的、高效的DON降解技術(shù)[10]。臭氧能破壞真菌毒素結(jié)構(gòu)中的雙鍵，對產(chǎn)毒真菌具有一定的滅活作用，從而達到降解真菌毒素的目的。此外，臭氧在使用后可自行分解為氧氣，無污染殘留[11，12]。研究表明，臭氧對谷物、水果和蔬菜中的真菌毒素均具有良好的降解效果，并且能夠改善食品的品質(zhì)[13，14]。本實驗研究了臭氧對固態(tài)DON、DON水溶液、小麥籽粒以及全麥粉中DON的降解效果及降解規(guī)律，并通過對比臭氧對以上不同基質(zhì)中DON的降解效果，研究基質(zhì)對DON的臭氧降解效果及規(guī)律的影響，從而為臭氧在降解小麥中DON的應用提供更廣泛和更深入的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霉病小麥：取3種染病程度不同的赤霉病小麥，初始DON含量分別為1.27、2.82、5.66 mg/kg，初始含水量分別為13.14%、11.61%、11.20%，編號依次為：L、M、H；鄭麥103；DON標品(純度≥99%)；乙腈(色譜級)；乙腈(分析級)；水(電阻率≥18.2 MΩ，TOC≤4 μg/L)。

1.2 儀器與設備

COM-AD-01臭氧發(fā)生裝置，JSA9紫外臭氧檢測器，F(xiàn)W-80高速萬能粉碎機，MLU-202布勒磨粉機，HJ-6A恒溫磁力攪拌器，12165001B多功能凈化柱，MTN-2800D氮吹濃縮儀，5810R高速離心機，F(xiàn)reezone 6plus真空冷凍干燥機，e2695高效液相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 臭氧處理

開啟臭氧發(fā)生器和紫外臭氧檢測器，預熱30 min以上，直至檢測器讀數(shù)穩(wěn)定，然后調(diào)零。設定臭氧濃度，稱取待測樣品，將其置于樣品反應瓶中進行處理。處理過程中，每隔20 min晃動樣品反應瓶，以保證臭氧與樣品充分均勻反應。

1.3.2 臭氧處理DON純品

用色譜級乙腈將1.0 mgDON標準品完全溶解，并定容至10 mL，得到100 μg/mL的DON標準儲備液。取適量標準儲備液，稀釋至10 μg/mL，取0.3 mL該溶液，用高純氮氣吹干，得到3 μg的溶質(zhì)，將該溶質(zhì)直接進行臭氧處理，研究臭氧對固態(tài)DON的降解效果；此外，取0.3 mL溶液，用高純氮氣吹干后，將其溶質(zhì)溶于1 mL的水溶液，得到3 μg/mL的DON水溶液，然后進行臭氧處理，研究臭氧對水溶液中DON的降解效果；臭氧處理濃度分別設置為0、2、4、6、8、10 mg/L，臭氧處理時間分別設置為0、10、30、60、120、240 s。

1.3.3 臭氧處理赤霉病小麥

取赤霉病小麥籽粒，參照GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》測定小麥含水量。將部分小麥籽粒除雜后用萬能粉碎機粉碎，粉碎后物料過40目篩，得到全麥粉，分別將這3種小麥籽粒和全麥粉按照1.3.1中步驟進行臭氧處理；另取部分M小麥籽粒，參照NY/T 1094.1—2006《小麥實驗制粉 第1部分：設備、樣品制備和潤麥》調(diào)節(jié)小麥含水量至15%，并參照NY/T 1094.2—2006《小麥實驗制粉 第2部分：布勒氏法 用于硬麥》，采用布勒磨粉機進行研磨制粉，通過以上步驟分別得到調(diào)質(zhì)后的小麥籽粒、調(diào)質(zhì)后的全麥粉、小麥粉以及麩皮，然后通入臭氧進行處理，以上臭氧處理濃度分別設置為0、20、40、60、80 mg/L，處理時間均為60 min。

1.3.4 料液比對DON的臭氧降解效果的影響

取H小麥籽粒及其全麥粉，分別按照料液比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6加入水，然后通入臭氧氣體進行處理，臭氧處理質(zhì)量濃度分別設置為0、20、40、60、80 mg/L，處理時間均為60 min。將經(jīng)臭氧處理后的小麥籽粒和全麥粉置于高速離心機中以4 000 r/min離心10 min，然后倒掉上清液，在-20 ℃冰箱中預凍24 h后，冷凍干燥48 h，取出后用粉碎機打粉，測定其中DON的含量。

1.3.5 小麥組分對臭氧降解DON效果的影響

取未染病小麥(鄭麥103)磨粉，得到麩皮和面粉；將面粉通過水洗法得到小麥淀粉和面筋蛋白。分別稱取等量的蛋白質(zhì)、淀粉和麩皮樣品(未加入組分的樣品作為對照組)，加入一定濃度的DON溶液，待各試管中樣品混勻后，將其放于4 ℃冰箱低溫避光保存過夜，以保證各組分與DON反應充分；將以上混合液置于臭氧反應裝置中處理，每個樣品的反應時間為60 s，臭氧質(zhì)量濃度分別設定為0、2、4、6、8 mg/L，處理完成后，置于4 ℃冰箱中過夜，以保證臭氧和各組分充分反應；待該混合液反應完全，測定其樣品液中DON總?cè)苜|(zhì)含量。

1.3.6 DON的測定

DON的提取、凈化、檢測及DON標準溶液的配制參照李萌萌[15]、劉遠曉等[16]的研究并稍作改動，具體操作步驟如下；

DON的提?。簻蚀_稱取25 g樣品置于250 mL燒杯中，加入100 mL提取液(乙腈/水=84∶16)，然后置于磁力攪拌器上攪拌20 min，靜置5 min。

DON的凈化：吸取5 mL靜置后的上清液過DON多功能凈化柱，準確收取濾液4 mL于具塞試管中，低溫下氮吹吹干，用流動相(乙腈/水=16∶84)復溶后置于高速離心機中以12 000 r/min離心5 min，然后過0.22 μm有機濾膜，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DON的檢測：使用高效液相色譜對DON進行檢測。色譜條件：色譜柱，C18反相色譜柱，4.6 mm×250 mm，填料粒徑5 μm；流動相，乙腈/水=16∶84；流速，0.6 mL/min；進樣量，10 μL；檢測方法，紫外檢測，波長218 nm。

DON標準溶液的配制：取1 mLDON儲備液低溫下氮吹吹干，使用流動相配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mg/L的標準工作液，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DON降解率的計算：DON降解率=(1-CA/C0)×100%

式中：CA為樣品經(jīng)不同方式處理后DON質(zhì)量濃度/mg/kg；C0為樣品中DON的初始質(zhì)量濃度/mg/kg。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均進行至少3次平行實驗，采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與前期處理，采用SPSS 20進行方差分析，多重比較采用Duncan式。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧對DON純品降解效果的影響

2.1.1 臭氧處理濃度對DON水溶液和固態(tài)狀DON的降解效果

洪澤縣境內(nèi)的縣鄉(xiāng)河道已進行了多輪治理，但以往河道整治主要是清淤。由于上游泥土的帶入、水體對河床的淘刷，局部河堤、河坡墾種、傾倒垃圾現(xiàn)象的存在，加速了河道的淤積速度，先期疏浚河道又有回淤現(xiàn)象，因此，仍不同程度存在引排不暢、水體交換緩慢、灌排效益下降等問題。

由圖1可知，臭氧不僅可以顯著降解DON水溶液，還可以降解固態(tài)狀DON，且在相同的處理時間條件下，其降解率均隨著臭氧處理濃度的增加而顯著升高。在臭氧質(zhì)量濃度為2 mg/L時，二者的DON降解率可達45%左右，在臭氧質(zhì)量濃度為10 mg/L時，DON降解率可達90%左右。與降解固態(tài)DON相比，水溶液中DON的降解率相對較高，當臭氧質(zhì)量濃度同為6 mg/L、處理時間為60 s時，臭氧對水溶液中DON的降解率可達83%，而對固態(tài)DON的降解率為60%左右，這可能是由于水的存在而導致的。有研究表明，臭氧氧化過程中，水的存在會影響DON的降解，它與DON的降解率呈正相關(guān)[17]。臭氧分子可溶解進入水中后形成·OH等自由基，再通過自由基降解DON，·OH自由基氧化能力比臭氧分子更強，進而提高了臭氧對DON的降解效果[18]。

2.1.2 臭氧處理時間對DON水溶液和固態(tài)狀DON的降解效果

由圖1可知，在臭氧處理濃度不變時，DON水溶液和固態(tài)狀DON的降解率均隨著臭氧處理時間的增加顯著升高。當臭氧質(zhì)量濃度為6 mg/L、處理時間為10 s時，水溶液中DON的降解率即可達到69.15%，固態(tài)狀DON能達到60%左右；這表明，臭氧在短時間內(nèi)即可對不同狀態(tài)下的DON純品產(chǎn)生良好的降解效果。有研究表明，使用質(zhì)量濃度為8 mg/L的氣態(tài)臭氧處理質(zhì)量濃度為2 μg/mL的DON水溶液，在15 s內(nèi)DON降解率即可達到95.68%[19]。DON對臭氧較敏感，較低濃度的臭氧即可對DON產(chǎn)生較好的降解效果。

由圖1可知，當臭氧濃度增大到一定程度、處理時間增長至一定值時，DON降解率的增速均呈現(xiàn)變緩的趨勢，這可能是因為在臭氧濃度和處理時間達到特定值時，臭氧對DON的降解達到了飽和。臭氧不僅可以在短時間內(nèi)降解水溶液中的DON純品，而且可以顯著降解固態(tài)DON純品，在采用臭氧降解DON的過程中，臭氧濃度和處理時間是影響DON的臭氧降解效果的兩大因素，適當?shù)奶岣叱粞鯘舛然蛟鲩L處理時間，均可顯著提高臭氧對DON的降解率[20，21]。

注： DON水溶液初始含量為(2.95±0.03) mg/kg，固態(tài)狀DON初始含量為(2.93±0.03) mg/kg，采用不同臭氧質(zhì)量濃度處理時，處理時間均為60 s，采用不同臭氧時間處理時，處理質(zhì)量濃度均為6 mg/L。圖1 臭氧處理濃度和處理時間對DON水溶液和固態(tài)狀DON的降解效果

2.2 臭氧對赤霉病小麥降解效果的影響

由圖2、圖3可知，臭氧處理可顯著降低小麥籽粒和全麥粉中DON的含量，降解率隨著臭氧濃度的增加而升高，且全麥粉中DON的降解率高于小麥籽粒。有研究表明，在臭氧質(zhì)量濃度為60 mg/L的條件下處理120 min后，小麥籽粒中DON的降解率為17.1%，而全麥粉中為26.4%，這是由于全麥粉與臭氧的接觸面積更大，DON能夠更徹底地和臭氧發(fā)生反應[22]。

可以看出，臭氧對不同含水量的樣品中的DON的降解效果不同，M樣品在含水量為11.61%、臭氧質(zhì)量濃度為80 mg/L時，DON的降解率為18.44%，在潤麥后，當含水量達到14.3%時，降解率可達27.62%。由此可見，小麥的含水量對小麥中DON的臭氧降解效果有一定影響，含水量高的樣品中DON降解率較高[23]。有研究表明，初始含水量為16%的小麥籽粒經(jīng)過臭氧處理后，DON的降解率比相同條件下臭氧處理初始含水量為11.3%的小麥籽粒高17%左右[22]，含水量為20.10%的小麥粉中DON的降解率顯著高于含水量分別為16.29%和11.79%的小麥粉[20]，這與本研究的結(jié)果趨勢一致。

注：處理時間均為60 min，L小麥籽粒、全麥粉，M小麥籽粒、全麥粉，H小麥籽粒、全麥粉初始DON含量為(1.27±0.05)、(2.82±0.07)、(5.66±0.06) mg/kg。 圖2 臭氧對染病程度不同的小麥中DON的降解效果

注：處理時間均為60 min,調(diào)質(zhì)后的小麥籽粒、全麥粉，小麥粉，麩皮中初始DON含量為(2.39±0.04)、(2.13±0.05)、(4.85±0.06) mg/kg。圖3 臭氧對小麥不同基質(zhì)中DON的降解效果

2.3 料液比對小麥籽粒和全麥粉中DON的臭氧降解效果的影響

從圖4可以看出，水分對小麥籽粒和全麥粉中的DON有一定去除效果，含水量越高，DON去除效果越好，在料液比為1∶1時，由于全麥粉加水量少，造成結(jié)塊嚴重，故基本不發(fā)生DON含量的降低。在加水量不斷增加時，小麥籽粒和全麥粉中DON的去除量隨著加水量的增加而升高，當料液比為1∶6時，小麥籽粒中的DON的去除率接近50%，全麥粉中DON去除率為67%左右，這可能是由于DON大多集中于表面并且易溶于水[25]。

注：料液比的大小與加水量的多少呈正比,小麥籽粒、全麥粉中初始DON含量為(5.66±0.01) mg/kg。圖4 料液比對小麥中DON的去除效果

由圖5和圖6可知，當用臭氧處理不同料液比的小麥籽粒和全麥粉時，DON的降解效果隨著料液比的增大而升高，且隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加也呈現(xiàn)升高的趨勢，在料液比為1∶6時，經(jīng)過質(zhì)量濃度為80 mg/L的臭氧處理60 min后，小麥籽粒中DON的降解率可達41%，全麥粉可達45%。有研究用不同料液比的臭氧水降解小麥中的DON，發(fā)現(xiàn)隨著料液比的增大，以及臭氧水濃度的升高，DON的降解率顯著升高，說明了臭氧和·OH的量增加，有利于DON的降解，且臭氧水濃度越高，DON與臭氧分子接觸越充分，生成的·OH也越多，因而降解作用越強[26]。

由圖5可知，當料液比由1∶4變至1∶6時，臭氧對小麥籽粒中DON的降解率不再升高，這可能是因為在實驗的過程中這兩種加水量的液面都能沒過籽粒，水與籽粒的接觸面積幾乎一致，因此，即使加水量增加，DON的降解率變化也不顯著。由圖6可知，與小麥籽粒不同的是，隨著料液比增加到1∶6時，臭氧對全麥粉中DON的降解率依舊呈現(xiàn)升高的趨勢，這可能是因為全麥粉與水混合后，變成了混合物，加水量越多，全麥粉在臭氧處理過程中與臭氧接觸機會越大，因此降解率越高。

注：處理時間均為60 min,料液比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6的小麥籽粒中初始DON含量為(4.28±0.17)、(4.23±0.09) mg/kg，(2.72±0.33)、(2.61±0.21) mg/kg。圖5 臭氧對料液比不同的小麥籽粒中DON的降解效果

注：處理時間均為60 min,料液比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6的全麥粉中初始DON含量為(5.63±0.45) 、(3.79±0.14) 、(2.38±0.23)、(1.82±0.13) mg/kg。 圖6 臭氧對料液比不同的全麥粉中DON的降解效果

2.4 小麥組分對臭氧降解DON效果的影響

由圖7可知，未加入組分的DON溶液的降解率遠遠大于加入3種組分的樣品組，這3種樣品組中，加入淀粉的樣品組中DON的降解率最高，麩皮次之，蛋白最低，且加入淀粉和麩皮的樣品組中DON的降解率均隨著臭氧濃度的增加而升高，而加入蛋白的樣品組的降解率呈現(xiàn)降低的趨勢，并呈現(xiàn)負值，這表明臭氧會引起蛋白質(zhì)多肽主鏈氧化、肽鍵斷裂以及蛋白質(zhì)交聯(lián)等一系列變化[27]，此時，與小麥蛋白發(fā)生結(jié)合的DON從面筋網(wǎng)絡中游離出來，導致樣品溶液中的DON含量增加。由此可見，在臭氧降解小麥中的DON時，麩皮、淀粉和蛋白均對其降解效果有著明顯的阻礙作用，且蛋白的阻礙作用最大。

圖7 小麥組分對臭氧降解DON效果的影響

3 結(jié)論

臭氧可以在短時間內(nèi)顯著降解水溶液中的DON和固態(tài)DON，且臭氧對這兩種狀態(tài)下的DON純品的降解率均隨著臭氧處理濃度和處理時間的增加而升高；臭氧對全麥粉中DON的降解率顯著高于小麥籽粒，對小麥粉和麩皮中DON也具有較好的降解效果，臭氧對接觸面積大和水分含量高的樣品中的DON的降解效果較好；臭氧對料液比不同的小麥籽粒和全麥粉有不同的降解效果，料液比增大，降解率也隨之升高，當加水量液面超過小麥籽粒時，隨著加水量的增加，小麥籽粒降解率不再升高，而全麥粉的降解率一直處于升高趨勢。本研究還發(fā)現(xiàn)，臭氧對DON純品的降解效果遠遠高于赤霉病小麥，這其中主要是小麥蛋白對其降解效果起到明顯的阻礙作用。

臭氧對不同基質(zhì)中的DON的降解效果不同，在臭氧降解DON的過程中，可通過適當提高臭氧的處理濃度和處理時間、增大臭氧與樣品的接觸面積、以及在合理范圍內(nèi)提高樣品的水分含量，防止樣品結(jié)塊，來提高臭氧對DON的降解效果。此外，小麥組分對臭氧降解DON有明顯的阻礙作用，因此，在未來的研究中，應著重于小麥組分對臭氧降解DON的影響規(guī)律及其機理方面的研究，為DON的臭氧降解技術(shù)的改進提供參考。