史乾坤 王心雅 甄 諾 牛 希周東方 張 浩 趙城彬 劉景圣

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;小麥和玉米深加工國家工程實驗室1，長春 130118)(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2，廣州 510515)

大豆分離蛋白(Soybean protein isolate，SPI)由于具有較高的營養(yǎng)價值、功能特性和相關(guān)的健康效應(yīng)，在食品制造中得到了廣泛的應(yīng)用。SPI是一種來自大豆的具有高品質(zhì)的植物蛋白[1]，SPI含有至少90%的蛋白質(zhì)[2]，在食品工業(yè)中，如嬰兒配方奶粉、豆腐、肉類和乳制品中，SPI的膠體特性得到了廣泛的應(yīng)用[3]。然而，未經(jīng)改性修飾的SPI表現(xiàn)出較差的凝膠性能。因此研究對其進行改性處理以提高SPI的功能特性。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutanminase，TGase)通過催化賴氨酸殘基的ε-氨基與谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基團之間的酰基轉(zhuǎn)移使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成共價ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸異肽鍵[4]。TGase可改變食源性蛋白的結(jié)構(gòu)和進而改善凝膠特性，包括大豆分離蛋白、豬肉肌原纖維蛋白、雞肌原纖維蛋白和魚類肌球蛋白[5-8]。SPI經(jīng)TGase酶交聯(lián)后，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)通過共價鍵(例如二硫鍵)和分子間ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸交聯(lián)連接[9]，TGase改性大豆蛋白具有較好的凍融穩(wěn)定性[10]。SPI包含大量的賴氨酸，但賴氨酸殘基由于大豆分離蛋白緊湊的結(jié)構(gòu)而埋在SPI分子中，從而限制了酶催化的效率。改性后的SPI裸露出大量的酶結(jié)合位點，經(jīng)TGase交聯(lián)作用可能促進共價ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸鍵的形成[11]。因此，適當(dāng)?shù)募庸ゎA(yù)處理可以促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開以及相關(guān)酶作用位點的暴露，促進TGase交聯(lián)反應(yīng)。

超高壓(Ultra-high pressure，UHP)是一種新的非熱技術(shù)，在食品加工業(yè)中引起了廣泛的關(guān)注。超高壓可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。超高壓對蛋白質(zhì)改性程度，取決于蛋白質(zhì)的種類、溫度和壓強大小以及保壓時間[12，13]。

已有研究結(jié)果表明超高壓對蛋白質(zhì)修飾的影響。例如，He等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與熱處理油菜分離蛋白相比，超高壓處理的油菜籽分離蛋白中可溶性蛋白聚集量較高，這可能與凝膠的質(zhì)構(gòu)特性得到改善有關(guān)。同樣，Zhu等[15]研究報道了超高壓處理下魚糜的展開肌原纖維結(jié)構(gòu)干擾了二硫鍵的形成和纖維基質(zhì)的生長。這些研究表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能通過超高壓處理而變化。此外，進一步的研究表明，壓力可以改變蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。超高壓(300～700 MPa)可以通過破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)來誘導(dǎo)完全變性。在稍低的壓力(>200 MPa)下，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)可能受到疏水鍵和二硫鍵的影響，而在低壓(150～200 MPa)下，通過氫鍵的形成來維持蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)[16]。高壓均質(zhì)作用能夠提高SPI乳液體系的穩(wěn)定性、流變學(xué)性質(zhì)和氧化穩(wěn)定性[17]。

UHP預(yù)處理復(fù)合TGase酶交聯(lián)可以改善SPI的凝膠性能。因此，本實驗研究超高壓預(yù)處理(100～500 MPa)對TGase誘導(dǎo)的SPI凝膠結(jié)構(gòu)和凝膠性能的影響，以期為超高壓在豆腐、奶酪、肉蛋白和蛋白質(zhì)飲料等食品蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(≥90%)、TGase(BR，200 U/g)、十二烷基硫酸鈉(99%)、Tris(98%)、二硫硝基苯甲酸(99%)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha1-4LDplus冷凍干燥機，Phenom臺式掃描電鏡，VERTEX 70傅里葉紅外光譜儀Q2000差示掃描量熱儀，DZ400/2SB真空包裝機，HPP600 MPa/30 L超高壓食品處理設(shè)備。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的超高壓處理

稱取一定量大豆分離蛋白粉溶解于蒸餾水中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的溶液，置于五層聚乙烯塑料袋(耐高溫高壓撓性塑料袋)中，以真空包裝機緊密密封，不留氣泡。將包裝好的溶液在25 ℃條件下，分別在100～500 MPa壓力下進行處理。

1.3.2 巰基含量的測定

參照Qin等[18]方法稍作修改，將經(jīng)過超高壓處理前后的大豆分離蛋白樣品稀釋到1 g/L，取稀釋樣品1 mL，加入2.0 mL的Tris-甘氨酸緩沖溶液(pH 8.0，含有10.4 gTris，6.9 g甘氨酸，1.2 g EDTA/L)和0.02 ml質(zhì)量濃度為4 g/L的Ellman試劑(此試劑含有4 g DTNB/L，用pH 8.0 Tris-甘氨酸緩沖溶液配制)，25 ℃保持20 min，采用分光光度計在412 nm處測定吸光值。實驗以不加蛋白液，而加Ellman試劑為空白。按照式(1)計算-SH的含量。

-SH=(73.53×A412×D)/C

(1)

式中：A412為有DTNB存在時蛋白液的吸光值減去無DTNB存在時蛋白液的吸光值；D為蛋白液的稀釋倍數(shù)；C為蛋白液的質(zhì)量濃度/g/L。

1.3.3 熱特性分析

樣品的熱特性通過差示掃描量熱儀(DSC)測定。參考張浩等[19]的方法稍加修改，取3 mg樣品于鋁盤中，壓片并以空鋁盤為對照。以10 ℃/min的升溫速率由20 ℃升至200 ℃，氮氣流速為50 mL/min。記錄此過程的起始溫度(Ti)、峰值溫度(Td)、終止溫度(Tf)和熱焓變(ΔH)。使用TA儀器通用分析軟件得到的熱曲線，計算出樣品的變性溫度。

1.3.4 粒徑分析

使用Malvern Mastersizer 2000測量粒徑分布和平均粒徑。將處理和未處理的蛋白質(zhì)溶液用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.0)稀釋至蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為1 g/L，取1 mL進行粒徑分析。

1.3.5 熒光光譜

內(nèi)源熒光光譜法參考Liu等[20]的方法并進行了修改。通過添加磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋至蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。以600 nm/min的掃描速度進行熒光光譜掃描，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為300～550 nm，狹縫寬度為15.0 nm。

1.3.6 TGase誘導(dǎo)的SPI凝膠的制備

凍干SPI配成質(zhì)量濃度為9 mg/100 mL的溶液，室溫攪拌1 h。添加20 U/mL溶液的TGase，快速攪拌10 s，最終TGase和SPI濃度分別為30 U/g，SPI的質(zhì)量濃度為9 mg/100 mL?；旌衔镌?0 ℃下反應(yīng)2 h，在90 ℃下滅活10 min，然后4 ℃過夜。

1.3.7 傅里葉紅外光譜

干燥條件下，將1 mg凝膠樣品與0.1 g溴化鉀用瑪瑙研缽充分研磨成均勻粉末，使用手動壓力機壓制成薄片，然后進行全波段掃描(4 000～400 cm-1)，掃描次數(shù)為64次，分辨率為4 cm-1，測定溫度為25 ℃。測定傅里葉變換紅外光譜曲線。

1.3.8 凝膠質(zhì)構(gòu)分析

參照Qin等[18]的方法，采用TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀對凝膠強度進行測定。將凝膠樣品放于測量臺上，采用P/0.5探頭，選擇TPA模式，設(shè)置壓縮前、壓縮中、壓縮后的速度分別為3.0、2.0、3.0 mm/s，凝膠壓縮比例為35%，2次下壓間隔5 s，觸發(fā)力為5 g。測定后得質(zhì)構(gòu)參數(shù)，凝膠強度以探頭下壓過程中的最大感應(yīng)力表示。

1.3.9 持水力(WHC)測定

參照Zhao等[21]的方法，稱取5 g蛋白凝膠置于50 mL離心管中，4 ℃、5 000 r/min離心15 min后除去水分，測定離心管中凝膠離心前后的質(zhì)量。每個樣品進行3次平行實驗。持水性按照式(2)計算。

(2)

式中：m0為離心管質(zhì)量/g；m1為離心前離心管和凝膠質(zhì)量/g；m2為離心后離心管和凝膠質(zhì)量/g。

1.3.10 NMR自旋-自旋弛豫時間測定

參照田海娟等[22]的方法。測試參數(shù)為：回波時間100 μs，8 000個回波，重復(fù)掃描32次，重復(fù)掃描間隔時間為3 000 ms，得到的信號衰減曲線為指數(shù)衰減曲線，利用核磁共振弛豫時間反演擬合軟件Ver4.09進行反演。

1.3.11 微觀形貌分析

參照Kahwa等[23]的方法，采用掃描電子顯微鏡觀察凝膠樣品的微觀結(jié)構(gòu)形貌，干燥的樣品用雙面導(dǎo)電膠固定在樣品臺上，用洗耳球輕吹樣品表面使樣品單層鋪于樣品表面，然后離子濺射噴金，置于掃描電鏡觀察臺上進行微觀結(jié)構(gòu)觀察。設(shè)置加速電壓為5 kV。

1.3.12 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)測定3次，用Origin 8.5和Graphpad prism 6.0繪制圖像，采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱特性分析

采用差示掃描量熱儀對經(jīng)超高壓處理前后的大豆分離蛋白的熱特性進行分析，結(jié)果如圖1所示。與未經(jīng)超高壓處理的大豆分離蛋白相比，超高壓處理后的的樣品在吸收峰位置發(fā)生偏移。DSC熱力學(xué)參數(shù)見表1，當(dāng)溫度在100～120 ℃時，樣品的吸收峰，分別為114.97、112.98、110.44、114.95、105.94、115.85 ℃，而超高壓處理之后樣品的ΔH與對照組相比均顯著提高(P<0.05)，分別為263.40、262.70、271.90、274.50、236.94 J/g，其中對照組為201.03 J/g，并且隨著壓強的增加而增大，說明超高壓改性后的大豆分離蛋白需要更多的熱量使蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生改變。但是當(dāng)壓強為500 MPa時，熱焓值相比400 MPa時下降37.60 J/g，這是由于蛋白結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重，不需要更多的熱量來破壞氫鍵以釋放水，表明與水的結(jié)合力不如400 MPa強。

圖1 超高壓處理前后大豆分離蛋白的DSC熱分析圖

表1 超高壓處理大豆分離蛋白的DSC熱力學(xué)參數(shù)

2.2 游離巰基含量

游離SH作為蛋白質(zhì)分子表面的反應(yīng)性功能基團，對蛋白質(zhì)凝膠化的特性產(chǎn)生較大影響。如圖2所示，超高壓處理之后的SPI游離SH在100～400 MPa呈上升趨勢，而500 MPa時的含量比400 MPa時低，可能是當(dāng)壓強達(dá)到500 MPa時，使得蛋白質(zhì)聚集，部分的巰基包埋在聚集體中，這一結(jié)果與Chen等[24]得到的結(jié)果一致。此外，Li等[25]的研究結(jié)果推測UHP處理誘導(dǎo)了SPI的部分展開和變性。這種蛋白的展開可能會通過UHP處理暴露出游離SH和埋在蛋白內(nèi)部的疏水殘基，從而導(dǎo)致游離SH增加。

注：不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)，下同。圖2 不同超高壓預(yù)處理水平對大豆分離蛋白游離巰基含量的影響

2.3 粒徑分析

如圖3所示，與實驗組相比，未處理過的蛋白質(zhì)顯示出較小尺寸分布。與未經(jīng)處理的蛋白質(zhì)相比，100～300 MPa處理后的蛋白質(zhì)粒徑增加，經(jīng)100 MPa處理的大豆分離蛋白具有較寬的粒徑分布，表明超高壓處理可以有效地改變蛋白質(zhì)的粒徑?？赡苁怯捎诔邏鹤饔闷茐姆枪矁r鍵，例如氫鍵和蛋白質(zhì)顆粒之間的疏水相互作用并改變天然蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)[26]。但是，在400、500 MPa超高壓處理后，蛋白質(zhì)粒徑減小，這表明在強力超高壓處理對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞程度較高，改善了大豆分離蛋白的粒徑大小。

圖3 不同超高壓預(yù)處理水平大豆分離蛋白的粒徑分布

2.4 熒光分析

內(nèi)在熒光主要來自色氨酸和酪氨酸殘基，它們對微環(huán)境的變化非常敏感。通過觀察熒光強度來反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[27]。從圖4可以看出，實驗組的熒光強度高于未處理樣品的熒光強度。隨著超高壓強度的增加，實驗組熒光強度先降低后升高，在400 MPa時達(dá)到最低，500 MPa時最高。原因可能是超高壓理破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不同的伸展和折疊結(jié)構(gòu)造成的，從而削弱了溶劑的猝滅作用。

圖4 不同超高壓預(yù)處理水平蛋白質(zhì)熒光強度的變化

2.5 超高壓處理對大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)的影響

表2是大豆分離蛋白經(jīng)超高壓處理前后蛋白凝膠二級結(jié)構(gòu)含量變化的對比。經(jīng)超高壓處理之后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生了顯著的變化，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增多，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角減少。與未經(jīng)過超高壓處理的大豆分離蛋白相比，經(jīng)過超高壓處理蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲存在顯著性差異(P<0.05)，這一結(jié)果與Qin等[3]結(jié)果一致。由此可以看出，超高壓處理TGase交聯(lián)會使大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變。

表2 保壓時間為10 min時蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量

2.6 質(zhì)構(gòu)特性

表3總結(jié)了大豆分離蛋白凝膠的TPA結(jié)果，包括7個參數(shù)：硬度、黏度、彈性、內(nèi)聚性、黏性、咀嚼性和彈力。隨著壓強從0增至400 MPa，硬度、黏性、內(nèi)聚性、咀嚼性和彈力值達(dá)到最大值，分別為729.10、554.87、0.74、230.46、0.54；然后增加到500 MPa時的除了彈性值增大，其他值都相對400 MPa時減小。400 MPa與對照組相比，硬度，黏度，彈性，內(nèi)聚性，黏性，咀嚼性和彈力之間均存在顯著性差異。UHP處理過的凝膠最初的凝膠硬度隨壓力水平的升高先升高后降低，在400 MPa達(dá)到最大值并達(dá)到729.21 g，這些結(jié)果與蛋白質(zhì)的預(yù)期變性和展開相吻合[14]。TPA結(jié)果表明，超高壓對大豆分離蛋白凝膠的凝膠的質(zhì)地特性有很大影響，在一定程度上可以改善凝膠性質(zhì)。

表3 大豆分離蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)參數(shù)

2.7 持水力測定

持水力(WHC)反映了凝膠系統(tǒng)中蛋白質(zhì)和水兩者之間的相互作用能力。蛋白質(zhì)的展開促進了TGase誘導(dǎo)的反應(yīng)并導(dǎo)致SPI凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定的均勻性和密度。此外，均勻而致密的微觀結(jié)構(gòu)可能會結(jié)合蛋白質(zhì)凝膠中的水，有助于增強WHC。此外，這些結(jié)果可能與TGase處理SPI后疏水殘基的暴露增加以及二硫鍵的形成有關(guān)。圖5顯示了在不同超高壓處理條件下蛋白質(zhì)凝膠的保水能力?？梢钥闯觯幚磉^的蛋白質(zhì)凝膠的保水能力均有不同程度的提高。在100～400 MPa范圍內(nèi)處理大豆分離蛋白，形成的凝膠持水性是成遞增趨勢的，在400 MPa時最大，其凝膠保水率達(dá)到92.27%，是未經(jīng)處理的1.28倍。圖5中的數(shù)據(jù)表明，達(dá)到500 MPa的最高壓力水平時，可能是過高的壓力水平導(dǎo)致蛋白之間交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞過度導(dǎo)致持水能力下降，結(jié)果與Ma等[17]報道的一致。

圖5 不同超高壓預(yù)處理水平對TGase交聯(lián)大豆分離蛋白凝膠持水能力的影響

2.8 凝膠內(nèi)部的水分分布以及水分遷移

大豆分離蛋白凝膠的T2橫向弛豫時間如圖6所示，分布在0.1～1 000.0 ms之間，出現(xiàn)了3個特征峰，其中T21(0.1～35.0 ms)區(qū)間是蛋白質(zhì)分子中極性基團與水以氫鍵形式結(jié)合的水，鍵能較大，不易斷開，該區(qū)間的水稱為結(jié)合水；T22(35～180 ms)區(qū)間為蛋白質(zhì)分子中的酰胺基與水以較小鍵能結(jié)合，為蛋白凝膠中多分子層水，與蛋白結(jié)合程度相對較差，是被凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)束縛的水分，被認(rèn)為是不易流動的水；T23(180～1 000 ms)區(qū)間為自由水，即蛋白樣品凝膠過程中未束縛進網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水，附著在蛋白凝膠的表面。大豆分離蛋白凝膠的自由水含量變化如圖7所示。在100～400 MPa范圍內(nèi)隨著壓強的增加，隨著壓強的增加，在400 MPa時自由水比例最小，達(dá)到94.48%，另外這是由于大豆分離蛋白更多的二級結(jié)構(gòu)被打開，游離巰基含量增多，導(dǎo)致結(jié)合水的能力增加，導(dǎo)致自由水含量減小。但再增加壓強達(dá)到500 MPa時，自由水為96.36%，這是由于壓強增大使形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，導(dǎo)致半結(jié)合水減少，自由水增多。

圖6 不同超高壓預(yù)處理水平對TGase交聯(lián)大豆分離蛋白凝膠T2弛豫時間的影響

圖7 不同超高壓預(yù)處理水平對TGase交聯(lián)大豆分離蛋白凝膠自由水含量的影響

2.9 微觀形貌分析

用掃描電子顯微鏡以表明不同的超高壓處理對TGase誘導(dǎo)的大豆分離凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu)的影響。凝膠的微觀結(jié)構(gòu)是其性能的重要決定因素，例如凝膠強度和WHC。圖8顯示了在不同壓力水平(0～500 MPa)后TGase誘導(dǎo)的大豆分離蛋白凝膠的一系列顯微圖像?？梢钥闯鑫醇訅禾幚淼鞍仔纬傻哪z表面結(jié)構(gòu)致密，成塊狀卷曲，而在100～500 MPa下加壓處理之后形成的大豆分離蛋白凝膠表面結(jié)構(gòu)發(fā)生疏松的變化，且隨著壓強的增加，凝膠表面結(jié)構(gòu)更加疏松，破碎程度增加，是由于相關(guān)的UHP處理，促進了大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的展開和TGase交聯(lián)，凝膠網(wǎng)絡(luò)變化的另一個可能原因可能是超高壓處理增加了大豆分離蛋白凝膠的斷裂力，斷裂活性和斷裂位移[17]。

圖8 不同超高壓預(yù)處理水平對TGase交聯(lián)大豆分離蛋白凝膠的掃描電子顯微鏡圖

3 結(jié)論

對大豆分離蛋白進行超高壓處理后，對大豆分離蛋白進行熱特性分析，結(jié)果表明隨著壓強的增加，熱焓值大小呈上升趨勢，在壓強達(dá)到400 MPa時，熱焓值最大。超高壓處理之后的SPI游離SH在100～400 MPa呈上升趨勢，在400 MPa時達(dá)到最大。對超高壓預(yù)處理TGase誘導(dǎo)交聯(lián)的大豆分離蛋白凝膠進行分析，結(jié)果表明，TGase交聯(lián)的大豆分離蛋白凝膠的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變，β-折疊含量和無規(guī)則卷曲含量增加，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減少；凝膠的持水能力得到提升，自由水比例減少，結(jié)合水含量增多，從而引起理化性質(zhì)的改變。此外，經(jīng)過超高壓處理后的TGase誘導(dǎo)交聯(lián)的大豆分離蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性也得到了較好的改善。本研究結(jié)果可以為在食品蛋白凝膠化行業(yè)中擴大大豆分離蛋白的利用方面提供一定的理論支持。