李 陽，馬 園，王國華，田普厚，李成龍，劉冬冬，張七斤

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古必威安泰生物科技有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 011500）

口蹄疫（foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物引起的，具有高度傳染性和重大經(jīng)濟(jì)意義的疫病，為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）要求的須通報(bào)動(dòng)物疫病[1]。FMDV隸屬于小RNA 病毒科口蹄疫病毒屬（Aphthvirus），在免疫學(xué)上分為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1 等7 種血清型[2]。FMDV 基因組全長約8 500 bp，由5'端非編碼區(qū)、開放性閱讀框（ORF）和3'端非編碼區(qū)組成[3]。ORF（全長6 500 nt）編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和8 種非結(jié)構(gòu)蛋白（Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3Cpro和3Dpol）。這些蛋白的主要功能是參加宿主免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)。其中VP1 蛋白暴露于病毒表面，最易發(fā)生變異，可使病毒突變株逃避抗體作用，從而獲得持續(xù)感染機(jī)會(huì)[4]。FMDV 抗原位點(diǎn)多位于衣殼蛋白的環(huán)結(jié)構(gòu)上，其中O 型FMDV至少包含5 個(gè)中和性抗原位點(diǎn)。O 型FMDV VP1蛋白作為ORF 區(qū)中P1 結(jié)構(gòu)蛋白基因所編碼的最重要的衣殼蛋白，在其GH 環(huán)（141～160 位氨基酸）和C 末端（200～213 位氨基酸）存在2 個(gè)線性表位，是FMDV 最重要的抗原位點(diǎn)，也是FMDV 變異的關(guān)鍵所在[5]。因此，VP1 蛋白是決定FMDV 抗原性誘導(dǎo)中和抗體和激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的主要抗原蛋白[6]。

近年來我國FMD 發(fā)病情況整體呈下降趨勢(shì)，其發(fā)生主要與動(dòng)物及其產(chǎn)品違規(guī)或跨境調(diào)運(yùn)，導(dǎo)致新毒株輸入有關(guān)，其中威脅最大的是來自東南亞、南亞和西亞-中東等地區(qū)的O、A 和Asia1 型[7]。例如：源自于南亞次大陸的O 型印度 2001 毒株（O/Ind-2001），2017 年由境外傳入我國，現(xiàn)有 a、b、c、d、e 5 個(gè)進(jìn)化分支[8]。源自東南亞的A 型東南亞 97 毒株（A/Sea-97）G1 和 G2 分支，分別于2009 年和2013 年傳入我國。O 型緬甸 98 毒株（O/Mya-98），于2010 年傳入我國[8]。而源自南亞的O 型泛亞（PanAsia）毒株早在1999 年前后就曾傳入我國，2011 年再次經(jīng)東南亞傳入，開始在國內(nèi)流行[9]，成為當(dāng)前和今后我國主要的流行毒株之一，須重點(diǎn)關(guān)注和防范[7]，加強(qiáng)該毒株疫苗的研發(fā)。本研究分析O 型PanAsia 毒株VP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)并預(yù)測其抗原表位，以期為該亞型毒株多表位疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 目的基因來源及編碼信息

在GeneBank 上獲取O/PanAsia 病毒株VP1基因序列（登錄號(hào)MH807443.1，片段長度639 bp）。該基因編碼的VP1 蛋白氨基酸序列如下：TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVS FILDRFVKVTPQNQINVLDLMQTPAHTLVGALLR TATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEAALDN TTNPTAYHKAPLTRLALPTAPHRVLATVYNGNCR YGTSPVTNVRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAI KATRVTELLYRKRAETYCPRPLLAIHPSEARHKQ KIVAPVKQLL。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)分析 通過在線軟件網(wǎng)站ProParam（https://www.expasy.org/resources/protparam），利用Expasy 工具分析其基本物理和化學(xué)性質(zhì)[10]。

1.2.2 跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性和信號(hào)肽預(yù)測 蛋白跨膜預(yù)測，使用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）工具；蛋白信號(hào)肽預(yù)測，采用SignaIP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/serv-ices/SignalP/）在線工具；蛋白親疏水性預(yù)測，使用Expasy 網(wǎng)站的ProScale（https://web.expasy.org/protscale/）工具[11]。

1.2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用DNAstar Protean 和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線分析軟件[12]。

1.2.4 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析建模，采用SWISS MODE（https://www.expasy.org/resources/swiss-model）工具；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，采用Phyre（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）軟件[13]。

1.2.5 B 細(xì)胞表位預(yù)測 采用ABCpred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）軟件和IEDB Analysis Resource（http://www.tools.iedb.org/main/）在線工具[14]。

1.2.6 T 細(xì)胞表位預(yù)測 利用SYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de//bin/MHCServer.d11/）在線分析軟件預(yù)測VP1 蛋白T 細(xì)胞表位；利用IEDB Analysis Resource（http://www.tools.iedb.org/main/）在線工具預(yù)測T 細(xì)胞抗原表位[15]。二者都是T 細(xì)胞受體（T-cell receptor/TCR）識(shí)別的抗原表位，但是預(yù)測方法不同，為后續(xù)結(jié)果提供了保障。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)

根據(jù)ProParam 分析可知，VP1 蛋白由213 個(gè)氨基酸組成，其中占比最高的前3 位分別為蘇氨酸（T，12.2%）、丙氨酸（A，11.3%）和亮氨酸（L，10.3%）。該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為23 520.83，pI 值為9.49，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為16 個(gè)，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為23 個(gè)。分子式為C1046H1670N300O309S4，脂溶指數(shù)為86.57，不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為25.14，分類為穩(wěn)定蛋白（＞40 判定為不穩(wěn)定蛋白）；與FMDV O 型Ind-2001 毒株VP1 蛋白相比，O/PanAsia 毒株的VP1 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量略低，pI 值略高，雖然不穩(wěn)定指數(shù)對(duì)比較高，但二者同為穩(wěn)定蛋白。

2.2 親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測

由ProScale 軟件分析可知，VP1 蛋白的平均親水性系數(shù)（GRAVY）為-0.309，最大值為1.656，最小值為-2.567（圖1），表明該蛋白為親水蛋白（GRAVY 值范圍為-2～2，負(fù)值表明為親水性蛋白），比典型O 型Ind-2001 毒株VP1 蛋白（GRAVY 值為-0.327）低一些。

圖1 VP1 蛋白親疏水性分析結(jié)果

由TMHMM 軟件分析可知，VP1 蛋白完全位于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）；采用SignaIP 軟件分析VP1 蛋白信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號(hào)肽存在（圖3），表明其為非分泌型蛋白。

圖2 VP1 蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果

圖3 VP1 蛋白信號(hào)肽分析結(jié)果

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SOPMA 軟件預(yù)測VP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)α-螺旋在VP1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中占比為28.17%，β-折疊占比為23.00%，而占比最多的區(qū)域?yàn)闊o規(guī)則卷曲（41.78%），占比最少的為β-轉(zhuǎn)角（7.04%），具體見圖4。該型與不同拓?fù)湫蚈/CHA/2/99 相比，α-螺旋占比高0.94%，β-折疊占比高4.22%，O/CHA/2/99 占比最多和占比最少的區(qū)域也為無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角。

圖4 SOPMA 軟件預(yù)測VP1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果

采用DNAstar Protean 軟件中的Gamier-Robson 和Chou-Fasman 兩種方法，對(duì)VP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。兩種方法預(yù)測的VP1 蛋白結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域分布如表1 所示。

表1 DNAstar Protean 軟件預(yù)測VP1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果

綜合上述兩種軟件對(duì)VP1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析結(jié)果，SOPMA 軟件預(yù)測VP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比最高，占比最少的區(qū)域?yàn)棣?轉(zhuǎn)角；DNAstar Protean 軟件預(yù)測的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊占比最高，無規(guī)則卷曲區(qū)域和轉(zhuǎn)角區(qū)域占相對(duì)較少。α-螺旋和β-折疊被認(rèn)為是蛋白的骨架區(qū)域，由于兩種結(jié)構(gòu)的特殊性，這兩個(gè)區(qū)域不利于形成位點(diǎn)。在VP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果中，雖然β-折疊占比較高，但是結(jié)合其親疏水性，預(yù)測VP1蛋白上存在多個(gè)抗原位點(diǎn)。

2.4 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SWISS MODEL 軟件同源構(gòu)建VP1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖5）。選擇5nem.1.A 為模板，發(fā)現(xiàn)序列相似度為95.24%，覆蓋值為0.99，GMQE（全球模型質(zhì)量估計(jì)）值為0.85，QMEAN值為-3.66。GMQE 是一種基于目標(biāo)模板對(duì)準(zhǔn)結(jié)合性質(zhì)的質(zhì)量估計(jì)，所得的分?jǐn)?shù)以0～1 的數(shù)字表示，反映了該對(duì)齊方式和模板構(gòu)建模型的預(yù)期準(zhǔn)確性以及目標(biāo)的覆蓋范圍，越接近1 表示模型越接近試驗(yàn)結(jié)果。QMEAN 對(duì)模型的質(zhì)量估計(jì)是基于蛋白模型的局部和全局計(jì)分，分值范圍為-0.4～0，越接近0表明模型結(jié)構(gòu)與相似大小的試驗(yàn)結(jié)構(gòu)之間具有良好的一致性。Phyre2 軟件預(yù)測VP1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，同源模板為d1qqp1，188 個(gè)殘基（88%的序列）通過單個(gè)評(píng)分最高的模板，以100%的置信度建模。結(jié)果（圖6）顯示，VP1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊（占比43%）為主，其次是α-螺旋（占比12%），與DNAstar 軟件預(yù)測的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。phyre 同源建模是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中尋找未知蛋白結(jié)構(gòu)的同源伙伴，將同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，構(gòu)建出預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，選擇1 個(gè)單體蛋白來建模[16]。

圖5 SIWSS MODEL 預(yù)測的VP1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型

圖6 Pryre 預(yù)測的VP1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型

2.5 B 細(xì)胞表面抗原表位預(yù)測

ABCpred 軟件是通過基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的一種預(yù)測方法[17]。通過ABCpred 軟件預(yù)測VP1 蛋白B 細(xì)胞表位，序列得分越高，表明作為表位的概率越高。選擇得分最高的前10 條序列，結(jié)果如表2 所示。

表2 ABCpred 預(yù)測VP1 蛋白B 細(xì)胞抗原表位結(jié)果

IEDB 在線軟件通過結(jié)合6 個(gè)方面的預(yù)測確定VP1 蛋白的抗原表位，分別為線性表位、β-轉(zhuǎn)角、表面可及性、骨架區(qū)柔韌性、抗原指數(shù)和親水性等。預(yù)測結(jié)果如圖7 所示。結(jié)合ABCpred 軟件分析結(jié)果，排除α-螺旋、β-折疊、疏水區(qū)等不易形成表位的區(qū)域綜合分析預(yù)測，確定了3 個(gè)B 細(xì)胞表位，分別是8～23 位（ADPVTATVENYGGETQ）、135～149 位（RYGTSPVTNVRGDLQ）和193～205位（AIHPSEARHKQKI）。

圖7 IEDB 軟件軟件預(yù)測VP1 蛋白B 細(xì)胞表位抗原結(jié)果

2.6 T 細(xì)胞表面抗原表位預(yù)測

抗原表位是抗原分子中誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的特殊化學(xué)基團(tuán)，主要分為B 細(xì)胞抗原表位和T 細(xì)胞抗原表位，而T 細(xì)胞抗原表位又分為細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic tlymphocyte，CTL）表位及輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）表位[18]。本研究綜合氨基酸殘基親水性、抗原性、可及性等預(yù)測抗原表位，隨后采用SYFPEITHI 軟件和IEDB等在線工具排除α-螺旋和β-折疊不易形成表位的結(jié)構(gòu)，與位于無規(guī)則卷曲處的氨基酸序列對(duì)比篩選預(yù)測出了T 細(xì)胞、B 細(xì)胞抗原表位，通過對(duì)比后得到發(fā)現(xiàn)CTL 細(xì)胞表位和Th 細(xì)胞表位是VP1 蛋白兩個(gè)主要的T 細(xì)胞表位，預(yù)測VP1 有10 個(gè)CTL細(xì)胞抗原表位，10 個(gè)Th 細(xì)胞抗原表位，最后篩選出了VP1 蛋白5 個(gè)CTL 優(yōu)勢(shì)表位和5 個(gè)Th 優(yōu)勢(shì)表位（表3～4）。

表3 T 細(xì)胞表面抗原表位預(yù)測結(jié)果

表4 T 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位預(yù)測結(jié)果

3 討論

FMD 是偶蹄動(dòng)物的一種高度傳染性疾病，豬、牛、羊以及許多野生物種對(duì)其均易感。FMD 影響世界許多地區(qū)，經(jīng)常導(dǎo)致大范圍流行[19]。在以農(nóng)業(yè)為主要支柱產(chǎn)業(yè)的國家，F(xiàn)MD 的暴發(fā)嚴(yán)重影響糧食安全和發(fā)展。FMDV 分為7 個(gè)血清型，目前國內(nèi)主要流行的是O 型和A 型。我國周邊FMD疫情不斷，導(dǎo)致多種毒株由境外傳入，比如O/MESA/PanAsia、O/SEA/Mya-98 和A/ASIA/Sea-97 毒株等。從我國周邊流行的病毒類型、流行頻率和循環(huán)區(qū)域位置判斷，O/PanAsia-2、A/Iran-05、Asia1/Sindh-08 和 O/Ind-2001 等毒株未來對(duì)我國養(yǎng)殖業(yè)威脅依然較大，因此制備亞單位疫苗將有利于我國FMD 的防控[1]。

本研究通過生物信息學(xué)軟件，分析O/PanAsia株VP1 蛋白的理化特性，發(fā)現(xiàn)VP1 蛋白總體上是一個(gè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的親水性蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域且該蛋白無信號(hào)肽存在。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成，其次為β-折疊。通過SWISS MODEL 軟件構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)VP1 蛋白具有多個(gè)可以形成表位的空間結(jié)構(gòu)。

表位預(yù)測在公共衛(wèi)生和基礎(chǔ)科學(xué)研究中具有重大意義。它適用于與表位相關(guān)的研究，比如亞單位疫苗候選多肽研究、自身免疫性疾病研究、過敏治療、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等[20]。當(dāng)前，在疫苗研究中使用生物信息學(xué)分析蛋白結(jié)構(gòu)和預(yù)測表位成為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的首選方案，與常規(guī)試驗(yàn)相比，采用生物信息學(xué)技術(shù)能夠使預(yù)測結(jié)果更加準(zhǔn)確和高效。曾江勇[21]預(yù)測豬FMDV Hankou/99 株結(jié)構(gòu)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及B 細(xì)胞抗原表位，表明該病毒除了VP1 區(qū)域，VP2 和VP3 也存在抗原表位。楊鑫等[22]通過預(yù)測Asia Ⅰ型VPl 結(jié)構(gòu)蛋白的B 細(xì)胞抗原表位，然后與國內(nèi)報(bào)道序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和比較，發(fā)現(xiàn)該毒株VP1 蛋白的抗原表位區(qū)域具有一定的差異。高瞻等[11]構(gòu)建了FMDV O/Ind2001 株VP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分子模型，并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了基于H2-Ld 及H2-Kd 兩種不同 MHC 限制性T 細(xì)胞表位及B 細(xì)胞抗原表位。與O/Ind2001 株比對(duì)VP1 蛋白的抗原表位發(fā)現(xiàn)，雖然部分抗原表位有一定的同一性，但不同拓?fù)湫投局曛g的VP1 蛋白結(jié)構(gòu)與表位還是存在差異。VP1基因在進(jìn)化或傳播過程中容易發(fā)生突變，這可能是FMD 難防難控的原因之一。因此，需要分析FMDV 不同拓?fù)湫偷膬?yōu)勢(shì)抗原表位，進(jìn)行多方位預(yù)測。鑒于FMDV 不同毒株之間不存在交叉免疫性，因此需要針對(duì)本地區(qū)流行毒株制備疫苗。

有研究[13]表明，α-螺旋和β-折疊區(qū)域位于蛋白內(nèi)部，易形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，較難形成表位。而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域較為松散，是很好的形成抗原表位區(qū)域。親水性強(qiáng)以及可及性和可塑性較好的區(qū)域也是形成表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)域，因此VP1 蛋白的結(jié)構(gòu)顯示出其具有很好的表位預(yù)測價(jià)值。

ABCpred 軟件和IEDB 軟件都具有很較高的預(yù)測精度，綜合兩者分析結(jié)果，預(yù)測VP1 蛋白的B 細(xì)胞表位為8～23 位、135～149 位和193～205 位氨基酸。本研究使用SYFPEITHI 和 IEDB 軟件分析了VP1 蛋白的T 細(xì)胞抗原表位，發(fā)現(xiàn)CTL 細(xì)胞表位和Th 細(xì)胞表位是VP1 蛋白兩個(gè)主要的T 細(xì)胞表位，預(yù)測VP1 有10 個(gè)CTL 細(xì)胞抗原表位，10個(gè)Th 細(xì)胞抗原表位，表明VP1 蛋白具有較好的免疫原性，最后篩選出了VP1 蛋白5 個(gè)CTL 優(yōu)勢(shì)表位和5 個(gè)Th 優(yōu)勢(shì)表位。而A 型病毒株AF72 表位VP1a 和VP1d 為病毒株AF72 結(jié)構(gòu)蛋白VP1 的優(yōu)勢(shì)B 細(xì)胞表位，21～40 位氨基酸是T 細(xì)胞表位，引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答；141～160 位及200～213 位氨基酸為B 細(xì)胞表位，引發(fā)體液免疫反應(yīng)[15]。A 型和O 型為FMDV 的不同亞型，因此其優(yōu)勢(shì)細(xì)胞表位也不同。通過生物信息學(xué)工具對(duì)VP1 蛋白的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測，證實(shí)VP1 蛋白能夠引起較強(qiáng)的CTL 表位免疫反應(yīng)。該研究盡管仍需試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但為預(yù)測抗原表位，選擇合適肽段，繼而制備多肽疫苗提供了理論依據(jù)。