楊樹寶，張英楠

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林 132013；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

呼吸道直接與外界相通，是機(jī)體最先接觸細(xì)菌、病毒等病原微生物的部位之一。呼吸道黏膜下的固有層內(nèi)存在一些淋巴組織，構(gòu)成了機(jī)體抵御外界病原微生物入侵的第一道免疫屏障，可提供對(duì)多種細(xì)菌和病毒等黏膜致病原侵襲的保護(hù)，這些淋巴組織被稱為呼吸道相關(guān)性淋巴組織（RALT），包括鼻黏膜相關(guān)淋巴組織（NALT）、支氣管相關(guān)淋巴組織（BALT）以及分布于喉和氣管黏膜中的淋巴組織[1-3]。存在于這些淋巴組織中的T、B 淋巴細(xì)胞是RALT 最重要的免疫細(xì)胞，對(duì)于局部及整個(gè)機(jī)體的免疫保護(hù)發(fā)揮重要作用。本課題組前期已經(jīng)對(duì)不同日齡家禽的鼻、氣管以及肺臟中的CD3+T淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞的定位分布變化進(jìn)行了報(bào)道[4-6]，并證明鼻、氣管和肺臟中淋巴細(xì)胞的類型、定位分布以及數(shù)量都呈日齡相關(guān)性變化，而這些變化又可以反映呼吸道黏膜及機(jī)體的免疫狀態(tài)。

喉作為呼吸道的重要組成部分，突出于呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)所組成的十字交叉處，此定位的特殊性和重要性使其成為黏膜免疫的關(guān)鍵部位。喉腔內(nèi)壁層是假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮，固有膜淺層有黏液性腺泡，其周圍分布有淋巴組織。一方面流經(jīng)鼻咽部的混于空氣中的懸浮顆粒和病原菌一定會(huì)經(jīng)過(guò)喉口進(jìn)入氣管或肺臟，另一方面，由支氣管和氣管所分泌的黏液也會(huì)經(jīng)過(guò)喉口進(jìn)入口咽部[7]。因此，喉作為下呼吸道的門戶，在呼吸道局部免疫中起到重要作用。目前關(guān)于喉部淋巴組織的研究較少，僅有學(xué)者對(duì)人和牛的喉部淋巴組織進(jìn)行過(guò)研究[8-11]，但是對(duì)家禽至今還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究利用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合計(jì)算機(jī)圖象分析技術(shù)觀察不同生長(zhǎng)發(fā)育階段T、B 淋巴細(xì)胞在喉黏膜中的出現(xiàn)、遷移、組織定位和分布等發(fā)育過(guò)程，從而反映不同發(fā)育時(shí)期雞喉黏膜的免疫狀態(tài)變化，以期為進(jìn)一步研究家禽喉黏膜的免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

200 枚海蘭白雞種蛋，購(gòu)自長(zhǎng)春凈月潭旅游開發(fā)區(qū)銀河養(yǎng)殖場(chǎng)。對(duì)種蛋進(jìn)行常規(guī)孵化，雛雞進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及用具

冰凍切片用OCT 組織包埋液，為美國(guó)Sakura公司產(chǎn)品；小鼠抗雞CD3 和Bu-1 單克隆抗體，為美國(guó)Southern Biotechnology 公司產(chǎn)品；Ultra Sensitive SP 超敏試劑盒kit 9901，為福州邁新公司產(chǎn)品；依愛EIF/C.DME3456 孵化機(jī)/出雛機(jī)，為廣東依愛孵化機(jī)廠產(chǎn)品；Leica CM1850 冰凍切片機(jī)，為德國(guó)Leica 公司產(chǎn)品；Olympus CX41 顯微鏡，為日本Olympus 公司產(chǎn)品；Pixera pro150ES 圖像采集器，為美國(guó)Pixera 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)200 只試驗(yàn)用海蘭白雞種蛋進(jìn)行孵化，雞出殼后置于動(dòng)物室中常規(guī)飼養(yǎng)。分別選擇未經(jīng)過(guò)疫苗免疫的18、20 日齡雞胚，以及1、4、7、14、21、35 和56 日齡的雛雞，每個(gè)時(shí)期取3 只雞胚或雛雞的喉。將喉組織制成冰凍切片，片厚5 μm，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組織化學(xué)染色程序

每張切片滴加3% H2O2，室溫下孵育10 min，然后PBS 洗3 次，每次3 min；除去PBS，每張切片分別滴加小鼠抗雞CD3 和Bu-1 單克隆抗體工作液，37 ℃孵育1 h，PBS 洗3 次，每次3 min；每張切片滴加聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），室溫下孵育20 min，PBS 洗3 次，每次3 min；每張切片加酶標(biāo)抗鼠/ 兔聚合物（試劑B），室溫下孵育30 min，PBS 洗3 次，每次3 min；以DAB 顯色后，使用蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗返藍(lán)；使用梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，最后以中性樹脂封片并照相。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Image-pro plus 6.0 圖像分析軟件，測(cè)定喉黏膜中單位視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞面積。同日齡選取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本制作3 張連續(xù)切片，每張切片在10 倍物鏡下隨機(jī)選取3 個(gè)視野，取平均值。應(yīng)用SPSS 18.0 軟件，對(duì)不同日齡的同一陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 胚胎期及出殼后1～7 日齡T、B 淋巴細(xì)胞分布規(guī)律

胚胎20 日齡和出殼后1 日齡時(shí)，喉黏膜中沒有CD3+T 淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞出現(xiàn)。4 日齡時(shí)，CD3+T 淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞都首次出現(xiàn)在喉黏膜中，而且都主要分布在喉腔底壁的正中黏膜嵴中（圖1-A、1-B），此時(shí)CD3+細(xì)胞的數(shù)量顯著高于Bu-1+細(xì)胞（P＜0.05，圖2）。

與4 日齡比較，7 日齡時(shí)喉黏膜中CD3+T 淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞的數(shù)量都顯著增加（P＜0.05，圖2），而且在喉黏膜中形成淋巴聚集物，其表面被覆假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮。淋巴聚集物中CD3+T 淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，但分布情況差異較大，CD3+T 淋巴細(xì)胞占據(jù)淋巴聚集物的中下部區(qū)域（圖1-C），而Bu-1+B 淋巴細(xì)胞主要位于淋巴聚集物外周，從整體分布上來(lái)看，二者恰好互補(bǔ)，分界較為明顯，除淋巴聚集物外其他部位很少有Bu-1+B 淋巴細(xì)胞存在（圖1-D）。

2.1 14～56 日齡T、B 淋巴細(xì)胞分布規(guī)律

與7 日齡比較，14 日齡時(shí)CD3+T 淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞數(shù)量變化不大（圖2），但是分布有較大變化：此時(shí)，喉黏膜中大的淋巴聚集物不多，而是淋巴細(xì)胞散布在幾乎所有部位的喉黏膜固有層中，局部形成小的淋巴聚集物（圖1-E）；Bu-1+B 淋巴細(xì)胞此時(shí)較CD3+T 淋巴細(xì)胞多，雖仍主要分布于CD3+T 淋巴細(xì)胞的外周，但分界不如7 日齡時(shí)明顯，有部分Bu-1+B 淋巴細(xì)胞穿插分布于CD3+T 淋巴細(xì)胞之間（圖1-F）。

21 日齡時(shí)，喉黏膜固有層中淋巴細(xì)胞更為集中，尤其是Bu-1+B 淋巴細(xì)胞此時(shí)較之前日齡更為集中（圖1-G），數(shù)量顯著高于14 日齡，并顯著高于CD3+T 淋巴細(xì)胞（P＜0.05，圖2）。

35 日齡時(shí)，喉黏膜中CD3+T 淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞的數(shù)量比21 日齡時(shí)均顯著增加（P＜0.05），而且此時(shí)Bu-1+B 淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于CD3+T 淋巴細(xì)胞（P＜0.05，圖2）。

56 日齡時(shí)，黏膜固有層底端出現(xiàn)主要由Bu-1+B 淋巴細(xì)胞構(gòu)成的生發(fā)中心（圖1-H），而CD3+T 淋巴細(xì)胞則分布在生發(fā)中心周圍的濾泡間區(qū)域（圖1-I）。此時(shí)整個(gè)喉黏膜中Bu-1+B 淋巴細(xì)胞和CD3+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量均較35 日齡有所增加，但是差異并不顯著（P＞0.05），但Bu-1+B 淋巴細(xì)胞的數(shù)量仍顯著高于CD3+T 淋巴細(xì)胞（P＜0.05，圖2）。

圖1 喉黏膜中淋巴組織及其T、B 淋巴細(xì)胞分布情況

圖2 喉黏膜中T、B 淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化

3 討論

研究喉黏膜淋巴組織中免疫細(xì)胞的分布對(duì)了解喉的免疫功能至關(guān)重要。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)不同日齡雞喉黏膜中CD3+T 淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞的定位分布變化進(jìn)行觀察，從而了解雞喉的免疫狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，4 日齡時(shí)，CD3+T 淋巴細(xì)胞和Bu-1+B 淋巴細(xì)胞都首次出現(xiàn)，而且都主要分布在喉腔底壁的正中黏膜嵴中。這些淋巴細(xì)胞之所以能都集中出現(xiàn)在喉腔底壁的正中黏膜嵴，其原因可能是此處位置較低，喉腔中的黏液更多地匯集于底壁，因此此處粘附空氣中的病原菌和顆粒物能力較強(qiáng)，另外正中黏膜嵴在此處突出，與經(jīng)過(guò)喉口進(jìn)入喉腔的氣體接觸頻繁，因此接觸病原的概率較大，并且此處黏膜較厚，固有層中血管等較發(fā)達(dá)，從而使免疫細(xì)胞較易在此處定殖，從而行使免疫功能。Casteleyn 等[8]對(duì)犢牛研究發(fā)現(xiàn)，在喉的會(huì)厭和杓狀軟骨突起部分黏膜中存在大量淋巴濾泡。犢牛喉腔中這些突起部位存在大量淋巴組織恰好與本研究發(fā)現(xiàn)的在雞喉腔底部突起的正中黏膜嵴中存在淋巴聚集物相似，也主要是由于這些突出部位會(huì)與經(jīng)過(guò)喉口進(jìn)入喉腔的氣體頻繁接觸，因此接觸病原概率較大，從而使免疫細(xì)胞較易在此處定殖，形成較為發(fā)達(dá)的淋巴組織。

14 日齡時(shí)，在喉口黏膜上皮轉(zhuǎn)換處，兩種黏膜上皮下淋巴細(xì)胞的分布截然不同，口腔側(cè)的復(fù)層扁平上皮下幾乎沒有Bu-1+B 淋巴細(xì)胞存在，而在喉腔側(cè)的呼吸性假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮下聚集了大量淋巴細(xì)胞，并形成淋巴聚集物。這說(shuō)明喉口處是喉部免疫的重要部位，作為氣體進(jìn)出的門戶，位于喉腔側(cè)的呼吸性假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮下的淋巴聚集物對(duì)抵御空氣中的病原菌起著重要作用，此處的淋巴組織可能更傾向于是喉部免疫的誘導(dǎo)位點(diǎn)，關(guān)于其具體的免疫機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

56 日齡時(shí)，黏膜固有層底端出現(xiàn)主要由Bu-1+B 淋巴細(xì)胞構(gòu)成的生發(fā)中心，而CD3+T 淋巴細(xì)胞則分布在生發(fā)中心周圍的濾泡間區(qū)域。由此可以證明，雞喉黏膜中的淋巴組織具有了黏膜相關(guān)性淋巴組織（MALT）的一般形態(tài)學(xué)和組成特征，屬于MALT 的一部分，可以命名為喉相關(guān)淋巴組織（LALT）。本研究也是對(duì)雞喉部淋巴組織進(jìn)行的首次研究，以后對(duì)于其免疫機(jī)制還將繼續(xù)展開研究。與本研究相似，Kracke 等[9]對(duì)人的研究發(fā)現(xiàn)，在兒童喉的聲門區(qū)域有發(fā)達(dá)LALT 存在，這些淋巴組織中有淋巴細(xì)胞密集分布的淋巴聚集物，黏膜上皮中有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。淋巴聚集物也主要由B 淋巴細(xì)胞組成，其中也含有少量CD3+T 淋巴細(xì)胞。