王海艷，石新華，蒙 嶸，李 昕，李鳳利，張小玲，盛萬里

（1.呼和浩特海關(guān)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；（2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

李斯特菌病是由單增李斯特菌引起的食源性疾病，具有較高的致死率，對嬰幼兒、老年人和免疫力低下的人危害更為嚴(yán)重，因此單增李斯特菌被列為重要的食源性病原體[1]。單增李斯特菌在自然環(huán)境中分布廣泛，幾乎存在于所有食品中[2]?，F(xiàn)已證實乳制品、肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、蔬菜等都是李斯特菌的感染源。該菌抵抗力很強，能夠耐受低pH 和高鹽環(huán)境，并且適宜生長的溫度范圍較寬。目前雖然不可能從食品中將該菌徹底清除，但可以通過有效的衛(wèi)生防制措施降低其在食品中污染水平，從而降低食品污染事件的發(fā)生風(fēng)險。

單增李斯特菌是乳粉中常見的致病菌之一。為了解其在乳粉中的生存特性，本研究將單增李斯特菌添加到不同水活性（Aw）的干乳粉、復(fù)水乳粉和熱沖調(diào)乳粉中建立不同的乳粉模型，然后對其生存特性進行研究，以期為乳粉中單增李斯特菌風(fēng)險評估和關(guān)鍵控制措施制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯、牛津瓊脂、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂、緩沖蛋白胨水等，購自北京陸橋有限公司；單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（54002、54003、54004、ATCC19111 和 ATCC19112），購自中國藥品生物制品檢定所和上海漢尼有限公司；試驗用乳粉，為本室保存。主要儀器包括生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、冰箱、pH 計、菌落計數(shù)器等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)和計數(shù) 將單增李斯特菌不同菌株復(fù)活后，接種于胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)18 h 后作為儲備菌；從儲備菌中挑取菌落接種于10 mL 胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)培養(yǎng)3 次后，等量混合各菌株，用蛋白胨水連續(xù)稀釋細(xì)菌混合物，取0.1 mL 用OXA平板計數(shù)。

1.2.2 不同Aw 干乳粉中單增李斯特菌生存特性

1.2.2.1 干乳粉制備 在無菌條件下，將經(jīng)檢驗無單增李斯特菌污染的乳粉置于55 ℃烘箱作用20 h進行烘干。

1.2.2.2 不同Aw 調(diào)制 將制備的乳粉分別放置于Aw 為0.81（含有飽和硫酸銨水溶液）、0.92（含有飽和硫酸鋅水溶液）和0.96（含有飽和硫酸鉀水溶液）密封罐中作用12 h，制成3 種Aw 乳粉用于人工接種試驗。

1.2.2.3 人工接種細(xì)菌 稱取制備的不同Aw 乳粉10 g 放入不同瓶中，按103cfu/g 的量將單增李斯特菌混合物加入其中并混勻，上面再覆蓋10 g相同Aw 的乳粉，然后密封。同時，按上述同樣方法制備原乳粉接種模型作對照。

1.2.2.4 細(xì)菌數(shù)量監(jiān)測與分析 將制備的乳粉模型分別置于4 ℃和25 ℃，定期取適量乳粉用緩沖蛋白胨水作10 倍系列稀釋后，再接種牛津瓊脂平板培養(yǎng)24 h 計數(shù)，并對數(shù)量變化取對數(shù)后進行變化趨勢分析。

1.2.3 復(fù)水乳粉中單增李斯特菌生存特性

1.2.3.1 不同溫度 將不含單增李斯特菌的乳粉與滅菌水按約1 g/6 mL 混合制成復(fù)水乳粉（14 g乳粉+86 mL 水）[1]，然后接種單增李斯特菌混合物（102cfu/mL），混勻后分別置于-1.5 ℃、4 ℃、8 ℃、室溫（18～25 ℃）、30 ℃、37 ℃、45 ℃培養(yǎng)，分別在24、48、72 h取培養(yǎng)物進行10倍系列稀釋后，接種牛津瓊脂平板培養(yǎng)24 h 計數(shù)。

1.2.3.2 不同pH 將制備的復(fù)水乳粉分別調(diào)節(jié)pH 為4.0、4.4、5.6、6.2、6.8、8.0、9.4，并分別接種單增李斯特菌混合物（102cfu/mL），混勻后分別置于4 ℃和30 ℃下培養(yǎng)；24、48、72 h 后，再分別取培養(yǎng)物進行10 倍系列稀釋，接種牛津瓊脂平板培養(yǎng)24 h 計數(shù)。

1.2.3.3 數(shù)據(jù)處理 將監(jiān)測的細(xì)菌數(shù)量取對數(shù)后進行變化趨勢分析。

1.2.4 乳粉中單增李斯特菌熱耐受性

1.2.4.1 培養(yǎng)基質(zhì)制備 將不含單增李斯特菌的原料乳粉和高糖高脂乳粉分別用60 ℃滅菌水按約1 g/6 mL 沖調(diào)，然后各取2 管，每管10 mL，置于60 ℃水浴中恒溫，同樣恒溫兩管10 mL 滅菌水。

1.2.4.2 細(xì)菌接種 按照107cfu/mL 的接種量將單增李斯特菌混合物分別添加于恒溫60 ℃沖調(diào)的原料乳粉、高糖高脂乳粉以及滅菌蒸餾水中，60 ℃分別作用5 min 和10 min。

1.2.4.3 菌量計數(shù)及數(shù)據(jù)分析 分別取經(jīng)熱處理的3 種接種物進行10 倍系列稀釋后，接種牛津瓊脂平板培養(yǎng)24 h 計數(shù)，將計數(shù)結(jié)果取對數(shù)后分析細(xì)菌衰減速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Aw 干乳粉中單增李斯特菌生存特性

2.1.1 4 ℃條件下 單增李斯特菌在Aw=0.96 的乳粉中能夠緩慢生長，而在Aw=0.81、Aw=0.92以及原乳粉中生長活力減退，但數(shù)量增減差異較小，均保持在103cfu/g 的水平（圖1），說明單增李斯特菌在低溫條件下的乳粉中能夠長期保持活力，且在較高Aw 時還會增長。

圖1 不同Aw 干乳粉中單增李斯特菌4 ℃條件下數(shù)量變化趨勢

2.1.2 25 ℃條件下 4 種Aw 乳粉中單增李斯特菌生長活力很快減退，經(jīng)過25 d，直接取樣進行細(xì)菌計數(shù)不能檢測到單增李斯特菌，只有經(jīng)過增菌培養(yǎng)復(fù)蘇后才能夠檢測到（圖2），說明干乳粉中的單增李斯特菌在25℃溫度下處于亞損傷狀態(tài)，會抑制單增李斯特菌的生長。

圖2 不同Aw 干乳粉中單增李斯特菌25 ℃條件下數(shù)量變化趨勢

2.2 復(fù)水乳粉中單增李斯特菌生存特性

2.2.1 不同溫度 復(fù)水乳粉中單增李斯特菌可生長的溫度范圍為-1.5～37 ℃，-1.5 ℃時生長緩慢，隨著溫度升高生長速率加快，37 ℃時生長速率最快且在48 h 內(nèi)可達(dá)對數(shù)生長最大值，但45 ℃時只存活24 h（圖3），說明單增李斯特菌對高溫的耐受性很小。

圖3 不同溫度下復(fù)水乳粉中單增李斯特菌數(shù)量變化趨勢

2.2.2 不同pH 在復(fù)水乳粉中，單增李斯特菌可適應(yīng)pH4.4～8.0 的環(huán)境，且在低溫（4℃）條件下對酸堿的耐受能力高于高溫（30℃）條件下的耐受能力（圖4）。

圖4 不同pH 下復(fù)水乳粉中單增李斯特菌數(shù)量變化趨勢

2.3 熱沖調(diào)乳粉中單增李斯特菌對熱耐受性

單增李斯特菌在熱蒸餾水中的衰減速率最快，而在熱沖調(diào)的原料乳粉中衰減速率較慢，在熱沖調(diào)的高糖高脂乳粉中衰減速率更慢（圖5），說明乳粉中的單增李斯特菌對熱有耐受性，且高糖高脂成分可增強其對熱的耐受能力。

圖5 單增李斯特菌在3 種不同基質(zhì)中的衰減速率比較結(jié)果

3 討論

單增李斯特菌廣泛分布于環(huán)境之中，由于其胞壁質(zhì)上有大量、以多樣形式鑲嵌的表面蛋白，所以與其他革蘭陽性菌不同，它具有很強的抵抗力，能適應(yīng)多種環(huán)境并在這些環(huán)境下復(fù)制、增殖和存活。許多資料表明，某些食品中的單增李斯特菌與其他無芽孢的食源性病原菌（如沙門菌和致病性大腸桿菌）相比熱耐受性更強[3]，且其熱耐受性受諸多因素影響，如培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件及食品特征（鹽濃度、Aw、糖和脂肪）等[4]。乳粉是單增李斯特菌生長繁殖的良好基質(zhì)，在乳粉加工的諸多環(huán)節(jié)中，如果衛(wèi)生條件不合格或消毒不徹底，乳粉受到該菌污染的可能性較大，存在食源性單增李斯特菌病暴發(fā)的危險。

本研究盡量模擬乳粉可能貯存的冰箱溫度（4 ℃）和室溫（25 ℃），通過人工方法將單增李斯特菌添加于不同Aw 的干乳粉中，評估單增李斯特菌在不同溫度條件下的生長與存活特性，初步了解了干乳粉中單增李斯特菌的生存特性。另外，復(fù)水奶粉中的單增李斯特菌能夠生長溫度為-1.5～37 ℃，在接近中性pH 范圍內(nèi)的復(fù)水奶粉中，單增李斯特菌在高溫條件下比在低溫條件下生長快，但在低溫條件下，單增李斯特菌對酸堿的耐受程度比在高溫條件下要大，在復(fù)水的高糖高脂奶粉中比在原料奶粉中衰減得慢，復(fù)水乳粉中的單增李斯特菌生存情況研究結(jié)果與Gay 等[5]的研究結(jié)果一致。復(fù)水奶粉如果污染單增李斯特菌，在低溫條件下貯存則能夠控制單增李斯特菌生長。

本研究建立沖調(diào)乳粉模型，對單增李斯特菌熱耐受性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳粉中單增李斯特菌的熱抵制能力明顯高于蒸餾水中的單增李斯特菌，而高糖高脂成分可提高單增李斯特菌的熱抵制能力。因此乳粉沖調(diào)時，在不影響乳粉營養(yǎng)成分的情況下，盡可能提高乳粉的沖調(diào)溫度。乳粉作為即食食品，其食用方法一般在40～70 ℃左右沖調(diào)飲用，但建議將沖調(diào)好的乳粉充分加熱一段時間后再飲用，以達(dá)到充分滅菌的效果。