張慶芳 ，韓鵬飛 ，謝丹丹 ，遲雪梅 ，遲乃玉 ，劉春瑩 *

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

海洋貝類具有肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、絕大多數(shù)種均可食用的特點(diǎn)，是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)海水貝類養(yǎng)殖面積達(dá)到120.4萬hm2，占海水養(yǎng)殖總面積的60.4%, 養(yǎng)殖海水貝類產(chǎn)量高達(dá)1457.9萬t，占總海水養(yǎng)殖量的70.6%[1]。隨著工業(yè)的不斷發(fā)展，大量的污染物質(zhì)被投放到水體中，造成水中氮、磷等元素大量累計(jì)，導(dǎo)致一些產(chǎn)毒微藻大量繁殖，其所產(chǎn)毒素大量富集在遷移能力較差的貝類體表和體內(nèi)，造成貝類死亡，人類食用后對(duì)健康產(chǎn)生巨大威脅[2-3]。最近，河北省秦皇島市出現(xiàn)了食用貽貝中毒的系列事件，通過檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有毒貽貝中麻痹性貝類毒素（Paralytic shellfish toxins，PSTs）含量超過了安全限量標(biāo)準(zhǔn)的2倍，目前仍沒有有效的藥物治療貝類毒素引發(fā)的中毒[4-5]。

PSTs 是貝類毒素中含量較高、范圍廣、毒性較強(qiáng)的毒素[6-9]，主要由海洋鞭毛藻屬產(chǎn)生，在牡蠣、 扇貝等濾食性雙殼貝類的消化器官中積累[10-11]。PSTs的毒性作用是通過在哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞中鈉通道的可逆阻斷實(shí)現(xiàn)的，由于鈉離子的流入對(duì)電位變化至關(guān)重要，阻斷它可以阻止動(dòng)作電位的形成，從而產(chǎn)生PSTs特有的神經(jīng)癥狀[12-14]，引發(fā)人體的神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷[5,15]。PSTs 中毒事件常暴發(fā)于全球溫帶和亞熱帶沿海地區(qū)，已經(jīng)引起了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生關(guān)注，具有明顯的毒性表征，口服致死量約為1 mg，對(duì)旅游業(yè)、餐飲行業(yè)造成了重大的打擊[16]。因此，加強(qiáng)對(duì)海產(chǎn)品貝類的毒素含量監(jiān)測(cè)，不斷探索可降解貝類毒素的方法，對(duì)于食用性貝類脫毒和養(yǎng)殖貝類脫毒具有重要意義。

目前PSTs 的清除方法可分為化學(xué)法、物理法和生物法。化學(xué)法目前是歐洲委員會(huì)批準(zhǔn)的一種凈化受污染產(chǎn)品的方法——氯水降解。但這種方法存在一定的問題，如氯殘留或副產(chǎn)物較多等[17]。物理凈化是通過加熱、吸附等來降低PSTs 含量的方法，但貝類毒素?zé)岱€(wěn)定性好，降解效率低[18]。生物法是利用微生物代謝或酶轉(zhuǎn)化貝類中的PSTs[19,20]。微生物降解毒素法是目前人們普遍認(rèn)同的對(duì)人體傷害少、更不會(huì)造成環(huán)境二次污染的一種方式[21-23]。C.J.Donovan 等[11]在紫貽貝中得到了能夠降解PSTs 的菌株；E.A.Smith 等[24]在幾種常見貝類中篩選得到了降解PSTs 的菌株。N-磺酰氨甲?；惗舅厥荘STs中占比較大的一類毒素，如何降解該類毒素是目前的研究熱點(diǎn)[6-7,9,25]，但目前關(guān)于微生物降解N-磺酰氨甲?；惗舅氐膱?bào)道很少，菌種資源匱乏，產(chǎn)業(yè)化更無法實(shí)現(xiàn)，其重要性也不言而喻。

本研究通過平板涂布篩選法，從大連渤海海域野生牡蠣消化腺中篩選得到4 株形態(tài)不同的菌株，并研究不同PSTs 毒素濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)能力的影響，旨在篩選出能夠降解N-磺酰氨甲?；惗舅氐奈⑸?，為接下來的食品和養(yǎng)殖中產(chǎn)業(yè)化降解貝類毒素研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

大連渤海海域（121°790398′E，39°033197′N）采集的野生牡蠣的消化腺。

1.2 主要試劑和儀器

N-磺酰氨甲?；惗舅貥?biāo)準(zhǔn)品CRM-C1&2-b，National Research Council Canada 提供； 硝酸銨-15N2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床（型號(hào)為CRY-2112），上海茸研儀器有限公司產(chǎn)品；生物安全柜（型號(hào)為L(zhǎng)A2-4A1），新加坡藝思高科技有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為L(zhǎng)TI-700），上海愛郎儀器有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，OY Growth Curves AB Ltd.L（Finland）產(chǎn)品；培養(yǎng)基所需的其他化學(xué)試劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基配制

海洋菌肉湯液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g·L-1，酵母粉1 g·L-1，氯化鈉19.45 g·L-1，無水氯化鎂5.9 g· L-1，硫酸鈉3.24 g·L-1，檸檬酸鐵0.1 g·L-1，氯化鈣1.8 g·L-1，氯化鉀0.55 g·L-1，碳酸氫鈉0.16 g·L-1，硼 酸0.022 g · L-1， 溴 化 鈉0.08 g · L-1， 氯 化 鍶0.034 g·L-1，氟化鈉0.0024 g·L-1，硝酸銨0.0016 g·L-1，磷酸氫二鈉0.08 g·L-1，pH值（7.6±0.2）。

海洋菌肉湯固體培養(yǎng)基：在海洋菌肉湯液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%的瓊脂。

1.4 降解N-磺酰氨甲?；惗舅鼐甑某鹾Y

將從大連渤海海域撈取的野生牡蠣的消化腺取出，稱重，為6.18 g，充分研磨后用200 mL無菌蛋白胨水沖洗（無菌環(huán)境中進(jìn)行），4 ℃、3000 r·min-1離心5 min，取上清液，得到牡蠣消化腺菌液。將得到的菌液以1%的接種量于10 mL 海洋肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h（30 ℃，160 r·min-1），當(dāng)菌液OD600值 達(dá) 到0.4～0.6 時(shí) 進(jìn) 行 梯 度 稀 釋， 取10-5、10-6、 10-7稀 釋 倍 數(shù) 的 菌 液， 分 別 與20 μL 的15.05 μmol · L-1、 150.50 μmol·L-1毒素標(biāo)準(zhǔn)品混合，涂布于海洋肉湯固體培養(yǎng)基上（對(duì)照組用不含有毒素的海洋肉湯固體培養(yǎng)基），30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，挑取生長(zhǎng)出的單菌落，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，將目的菌株進(jìn)行分離純化及保藏，用于進(jìn)一步研究。

1.5 降解N-磺酰氨甲?；惗舅鼐甑膹?fù)篩

將初篩得到的菌以2%的接種量分別加入到含有15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1N-磺酰氨甲?；惗舅貥?biāo)準(zhǔn)品的250 μL 海洋肉湯液體培養(yǎng)基中，以不加N-磺酰氨甲?；惗舅氐暮Ｑ笕鉁后w培養(yǎng)基作為對(duì)照組，30 ℃、160 r·min-1進(jìn)行培養(yǎng)，間隔2 h 取1 次樣，用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀培養(yǎng)和檢測(cè)培養(yǎng)液OD600值，每組3 個(gè)平行；繪制菌株的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)其生長(zhǎng)情況初步判斷菌株是否具有利用、降解N-磺酰氨甲?；惗舅氐哪芰?。

1.6 菌株的鑒定

將能夠利用毒素的菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單染色及革蘭氏染色鏡檢，并觀察其菌落特征，對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解N-磺酰氨甲?；惗舅鼐N篩選

能夠在含有N-磺酰氨甲酰基類毒素的海洋肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)的菌株，可能具備降解該毒素或者耐受該毒性的特性。分別用含有15.05 μmol·L-1、150.50 μmol·L-1濃度N-磺酰氨甲?；惗舅氐某鹾Y培養(yǎng)皿進(jìn)行牡蠣消化腺菌液培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在含有毒素的初篩培養(yǎng)皿中，菌落數(shù)量減少；在含有高濃度毒素初篩培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)明顯少于低濃度培養(yǎng)皿菌落數(shù)（見圖1a、b），說明毒素對(duì)于大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)具有抑制作用，而能夠在高濃度毒素初篩培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的微生物，對(duì)該毒素具有更高的耐受性或者降解能力。通過菌落及菌體形態(tài)觀察（見表1），初步判斷從牡蠣消化腺中篩選得到了疑似能夠降解或耐N-磺酰氨甲?；惗舅氐? 株菌，命名為H-1號(hào)、H-2號(hào)、H-3號(hào)、H-4號(hào)；這4株菌的菌落形態(tài)均為表面光滑、濕潤(rùn)，菌體為桿狀或球狀，無芽孢，可以初步判斷皆為細(xì)菌。并對(duì)比各菌株在無毒及有毒情況下菌體的形態(tài)變化（見表1），結(jié)果顯示加了一定量毒素后菌株個(gè)體都比不加毒素小且形態(tài)均一。

表1 初篩得到的4株菌的形態(tài)學(xué)特征

圖1 牡蠣消化腺菌液在含毒初篩培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況

2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

分別在加入了15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1N-磺酰氨甲?；惗舅氐暮Ｑ笕鉁囵B(yǎng)基中培養(yǎng)初篩得到的4 株菌，繪制其生長(zhǎng)曲線，同時(shí)與未加毒素的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見圖2。

圖2 初篩菌株在不同毒素濃度下的生長(zhǎng)曲線

H-1菌株（見圖2a）在較低濃度（0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1）毒素下，生長(zhǎng)趨勢(shì)和對(duì)照組（0 μmol·L-1）相似，基本不受影響；但在高濃度（15.050 μmol·L-1）毒素下，培養(yǎng)0～16 h 時(shí)基本不生長(zhǎng)，處于延滯期，16 h 后才開始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，OD600值低于對(duì)照組，說明高濃度毒素對(duì)H-1 菌株的生長(zhǎng)有抑制作用。

H-2 菌株（見圖2b）在不同濃度毒素（15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1）下，其生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組（0 μmol·L-1） 基本相同，OD600值變化不大，說明不同濃度的毒素對(duì)菌株生長(zhǎng)基本無影響，該菌株可能具有耐毒的作用。

H-3 菌株（見圖2c）在培養(yǎng)0～16 h 時(shí)，較低濃度毒素（0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1） 下生長(zhǎng)趨勢(shì)和對(duì)照組（0 μmol·L-1）相似，高濃度毒素（15.050 μmol·L-1）下生長(zhǎng)趨勢(shì)相較于對(duì)照組生長(zhǎng)緩慢，這說明在高濃度毒素下，菌株生長(zhǎng)前期得到馴化；培養(yǎng)16～30 h時(shí)，添加不同濃度毒素的菌株的OD600值均高于對(duì)照組，且隨著毒素濃度的增加而增加，這說明該菌株可能具備降解毒素的能力。

H-4 菌株（見圖2d） 在3 個(gè)毒素濃度（15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1）下的生長(zhǎng)趨勢(shì)和對(duì)照組（0 μmol·L-1）相似，OD600值變化不大，說明不同濃度（15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301μmol·L-1）的毒素對(duì)菌株生長(zhǎng)基本無影響，該菌株可能具備耐毒的作用。

綜上判斷，H-3 號(hào)菌株具有降解利用N-磺酰氨甲?；惗舅氐哪芰Γ琀-2、H-4號(hào)菌株具有較好的耐N-磺酰氨甲酰基類毒素的能力。

2.3 染色結(jié)果

將篩選得到的菌株H-2、H-3、H-4 號(hào)進(jìn)行革蘭氏染色，染色結(jié)果見圖3。圖3顯示，H-2、H-3號(hào)和H-4 號(hào)菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，但H-4 號(hào)菌株著色較淺。

圖3 菌株革蘭氏染色結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究從渤海海域野生牡蠣消化腺中篩選得到了一株能夠利用N-磺酰氨甲?；惗舅氐暮Ｑ蠹?xì)菌H-3，兩株耐N-磺酰氨甲?；惗舅氐暮Ｑ蠹?xì)菌H-2和H-4。不同濃度毒素對(duì)上述菌株生長(zhǎng)情況的影響結(jié)果顯示，H3 菌株對(duì)低濃度毒素（0.750 mmol·L-1、0.301 mmol · L-1） 具有耐 受 力， 而高濃 度 毒素（15.050 mmol·L-1）在H3 菌株生長(zhǎng)前期降低了其生長(zhǎng)速度，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，H3 菌株明顯表現(xiàn)出能夠利用毒素的能力；且隨著毒素濃度的增加，其生長(zhǎng)量逐漸升高，這可能意味著經(jīng)過毒素的馴化，H-3號(hào)菌株對(duì)于毒素的降解利用率得到了提高，且有可能具備降解其他種貝類毒素的功能。結(jié)果為今后研究麻痹性貝類毒素的降解提供了菌種資源。H-2 和H-4 菌株主要表現(xiàn)出對(duì)N-磺酰氨甲酰基類毒素的耐受，其降解該毒素的能力還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本研究通過將毒素和菌液混合后涂平板進(jìn)行篩菌，這種方式操作簡(jiǎn)便、可行性強(qiáng)、節(jié)約成本，也為其他菌株的篩選提供一種簡(jiǎn)便、可行的方法。

鑒于目前貝毒通過海產(chǎn)品的食用而富集在人體內(nèi)引發(fā)一系列疾病，甚至死亡，也造成海產(chǎn)品在養(yǎng)殖過程中貝毒含量超標(biāo)而影響?zhàn)B殖業(yè)的收入，造成經(jīng)濟(jì)收益降低等情況，可對(duì)這種具有耐或降解麻痹性貝類毒素能力的菌株進(jìn)行發(fā)酵條件、降解毒素機(jī)理、代謝機(jī)制、基因克隆表達(dá)等進(jìn)一步研究，例如期望得到能夠直接降解麻痹性貝類毒素的酶，用于快速檢測(cè)麻痹性貝毒含量；或通過耐毒與不耐毒的菌株混合，制成檢測(cè)麻痹性貝毒試劑，根據(jù)兩種菌株生長(zhǎng)量來判定貝類毒素的含量范圍；也可開發(fā)成微生物制劑，通過降解藻類產(chǎn)生的毒素或者降解貝類消化腺內(nèi)的毒素來降低對(duì)人類的危害，可廣泛應(yīng)用于海洋食品生產(chǎn)和養(yǎng)殖行業(yè)。