陳 蕓， 劉 苗， 張魯榕， 繆蔚冰

甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)是女性第5大常見癌癥[1]，其發(fā)病率逐年上升，其中分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer, DTC)占90%以上，經(jīng)手術(shù)切除、放射性碘治療及促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)抑制治療，大部分患者預(yù)后較好，但仍有20%的患者預(yù)后較差[2]。近年，免疫治療備受關(guān)注，鑒于131I治療后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)(如淋巴細胞轉(zhuǎn)化，抗原激活的淋巴細胞亞群及抗TC抗體滴度)的相關(guān)報道較少，本研究旨在探討131I治療DTC患者導(dǎo)致的細胞免疫及體液免疫的變化。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2017年1-6月在核醫(yī)學(xué)科住院行131I治療的DTC術(shù)后患者74例，男性27例，女性47例，年齡中位數(shù)46.7歲(18～72歲)，病理診斷均為乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)，且均已行甲狀腺全切術(shù)或近全切除術(shù)。排除131I治療前TSH水平<30 mIU/L者，合并其他類別腫瘤者，以及不配合實驗或隨訪失敗者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

依據(jù)病情將74例患者分為2組：(1)清灶組(radiotherapy, RT)，131I治療后全身顯像提示具有攝131I的轉(zhuǎn)移病灶者，或停用左旋甲狀腺素片(levothyroxine，L-T4)3周后甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)>10 μg/L者，共42例，男性14例，女性28例；年齡中位數(shù)44歲(26～52歲)；9例伴肺轉(zhuǎn)移，2例伴骨轉(zhuǎn)移，31例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；131I治療2次25例，治療≥3次17例，131I劑量為(5.85±1.07)GBq(圖1A)。(2)清甲組(radioiodine remnant ablation, RRA)，131I治療后全身顯像提示，除甲狀腺床區(qū)外無異常放射性濃聚者，或隨訪抑制狀態(tài)(即TSH<0.01 mIU/L)下Tg<0.2 μg/L者，共32例，男性13例，女性19例；年齡中位數(shù)48歲(31～51歲)；均初次行131I治療，131I劑量為(4.4±0.59)GBq(圖1B)。

A：清灶組；B：清甲組。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細胞轉(zhuǎn)化的測定 人源TC 8305C由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司提供，細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2、飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化細胞。培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，經(jīng)過劑量率為200 cGy/min的直線加速器(Varian Rapid Arc Trilogy 5918，美國瓦里安醫(yī)療系統(tǒng)公司)照射4 min，制備出TC新型誘導(dǎo)性瘤苗。收集131I治療前及治療后45 d的外周血淋巴細胞，分成2份，以每孔1×106個細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置不加腫瘤抗原(Ag-)和加入50 μg/mL的TC新型誘導(dǎo)性腫瘤抗原(Ag+)2組，均在含有5 μmol/L 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h。另設(shè)置1個不加EdU培養(yǎng)基的對照組。細胞固定化后采用1×Apo染色，上流式細胞儀(美國BD公司)檢測。

1.2.2 淋巴細胞亞群變化的測定 收集TC細胞蛋白抗原刺激后的淋巴細胞，采用自身對照的方法，用FITC-抗人CD4或CD8及PE-抗人IFN-γ(美國BD Biosciences公司)進行熒光抗體單染或雙染，用流式細胞儀檢測染色陽性的CD4+、CD4+IFN-γ+、CD8+和CD8+IFN-γ+4組T淋巴細胞的百分比，統(tǒng)計每個患者不同時間點外周淋巴細胞加或不加TC抗原刺激的EdU值(即Ag+或Ag-的EdU值)，并以二者的比值作為EdU值的變化倍數(shù)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA-like)檢測血清抗TC細胞蛋白抗體滴度 以TC細胞蛋白作為包被抗原調(diào)節(jié)至50 μg/mL的濃度，按照每孔100 μL包被于EILISA專用的酶標板(上海碧云天生物技術(shù)公司)上，放置平穩(wěn)，4 ℃避光過夜，加入不同稀釋倍數(shù)的一抗(131I治療前及治療45 d后患者的血漿)。加入1∶4 000的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)-抗人IgG(北京博爾西科技有限公司)，每孔100 μL，加入3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)顯色液(湖南華騰制藥有限公司)(按1∶10混合)，每孔100 μL，在酶標儀上測定450 nm波長下的OD值?？贵w滴度的判定標準：(治療后OD值-空白對照OD值)/(治療前OD值-空白對照OD值)≥1.2為陽性，出現(xiàn)陽性顯色的最高稀釋倍數(shù)即為抗體滴度。

2 結(jié) 果

2.1131I治療前后的淋巴細胞轉(zhuǎn)化幅度 (1)TC淋巴細胞轉(zhuǎn)化幅度治療后較治療前明顯升高，131I治療前后EdU值的變化倍數(shù)分別為(0.95±0.49)及(1.37±0.85)，二者差別有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.817，P<0.05)(圖2A)。(2)131I治療后的淋巴細胞轉(zhuǎn)化與治療前比較，清灶組升高19例，陽性率83%，清甲組升高7例，陽性率58%，2組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.433，P>0.05)。(3)131I治療前后TC淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗EdU值的變化倍數(shù)，清灶組分別為(0.97±0.55)及(1.80±1.84)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.593，P<0.05)(圖2B)；清甲組分別為(0.91±0.36)及(1.18±0.59)，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.136，P>0.05)(圖2C)。

A：乳頭狀甲狀腺癌；B：清灶組；C：清甲組。與治療后的比較，☆：P<0.05。

2.2131I治療前后的淋巴細胞亞群變化

2.2.1 清灶組和清甲組淋巴細胞亞群變化例數(shù) (1)131I治療后組內(nèi)比較，清灶組CD4+、CD4+IFN-γ+、CD8+淋巴亞群降低的例數(shù)較多，而CD8+IFN-γ+升高的例數(shù)較多；而清甲組4個淋巴亞群均以降低為主；(2)2組間比較，清灶組CD8+IFN-γ+升高比例較清甲組明顯增高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余亞群2組間比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 清灶組和清甲組淋巴亞群治療前后變化例數(shù)比較

2.2.2 清灶組和清甲組淋巴細胞亞群變化幅度131I治療后，清灶組CD4+IFN-γ+、CD8+、CD8+IFN-γ+淋巴亞群均升高，CD4+淋巴亞群降低，但與治療前比較，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義；而清甲組4個淋巴亞群均降低，其中CD8+淋巴亞群降低幅度與治療前比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 清灶組淋巴亞群治療前后比較

2.3131I治療前后血清抗TC細胞蛋白抗體的變化

2.3.1131I治療誘導(dǎo)的特異性抗體滴度回歸分析 將性別、年齡、131I等進行二元Logistic回歸分析，以抗體滴度為因變量。在滴度為1∶80 000時，治療后OD值/治療前OD值≥1.2為陽性。年齡賦值根據(jù)目前分期為標準進行劃分。以抗體滴度為因變量(Y)，以可能影響滴度的所有因素為自變量(X)，包括性別、年齡和131I劑量。131I為滴度陰陽性的影響因素(P<0.05)，即131I劑量越高，抗TC細胞蛋白抗體滴度呈現(xiàn)陽性的可能性越大。131I劑量每增加1 Bq，滴度陽性率增加1.018倍(95% CI：1.000～1.036，P<0.05)。

2.3.2 清灶組和清甲組131I治療誘導(dǎo)的特異性抗體滴度陽性率 清灶組與清甲組均產(chǎn)生了抗TC細胞蛋白抗體，第一期結(jié)果顯示，當抗TC細胞蛋白抗體最高滴度達1∶80 000，清灶組和清甲組的陽性率分別是64%和56%；第二期結(jié)果顯示，當抗TC細胞蛋白抗體最高滴度1∶640 000，清灶組和清甲組的陽性率分別是38%和33%。2組在引起體液免疫反應(yīng)上差別無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.546，P>0.05，表3)。

表3 清灶組和清甲組抗甲狀腺癌細胞蛋白抗體滴度的變化

3 討 論

過去報道的淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗多為非特異性，即使用刀豆素(concanamycin，ConA)、植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)作為免疫刺激原[3-4]，仍無法用于探討131I治療后特異性抗TC細胞免疫的改變。本研究采用的抗腫瘤細胞免疫的創(chuàng)新檢測方法[5]，能夠動態(tài)監(jiān)測TC131I治療后特異性抗TC的細胞免疫及體液免疫的變化。

免疫治療包括主動免疫治療和被動/過繼免疫治療。癌癥被動/過繼免疫治療的障礙之一是免疫激活不足，免疫效應(yīng)物質(zhì)消失后，療效大多不能持久維持[6]。主動免疫反應(yīng)主要是利用腫瘤細胞的免疫原性，采用各種有效的免疫手段使宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性針對腫瘤的主動免疫效應(yīng)[7]，在體內(nèi)誘導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)，直接殺滅腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，外照射(常規(guī)放射，立體定向放射治療)和內(nèi)照射(射頻消融，90釔放射性栓塞)均可通過不同的特性引起腫瘤細胞免疫原性死亡，引起“疫苗效應(yīng)”，增強免疫反應(yīng)[8-10]，尤其是90釔放射性栓塞，可通過釋放β射線殺傷腫瘤細胞，引發(fā)主動免疫效應(yīng)，與131I的治療原理一致。

機體發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)是由于腫瘤抗原被抗原提呈細胞攝取，提呈給淋巴細胞，使之活化、增殖，進而活化為CD4+IFN-γ+或CD8+IFN-γ+的T淋巴細胞亞群，從而發(fā)揮抗腫瘤主動免疫效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，DTC患者131I治療后，淋巴細胞轉(zhuǎn)化升高，且發(fā)揮抗腫瘤作用的CD8+T細胞在清灶組和清甲組間呈現(xiàn)不同的趨勢，清灶組CD8+T細胞呈上升趨勢，清甲組則為下降趨勢，并且清灶組的CD8+IFN-γ+T淋巴細胞升高例數(shù)的比率高于清甲組(56%vs8%，P<0.05)，說明清灶組在131I治療后能夠較好地誘導(dǎo)活化的CD8+T細胞，從而更好地殺滅甲狀腺癌細胞，這與文獻報道一致[11]，認為放療前后CD8+T細胞升高與放療的療效呈正相關(guān)，CD8+T細胞可側(cè)面反映機體抗腫瘤的情況。本研究發(fā)現(xiàn)，131I治療后清灶組和清甲組的CD4+T細胞均未升高，原因可能是CD4+T淋巴細胞(即Th1、Th2和Th17細胞，Treg細胞和T濾泡輔助細胞)的每個子集發(fā)揮不同的對抗腫瘤免疫力的效應(yīng)?？梢奣淋巴細胞亞群可能在一定程度上反映131I治療后腫瘤細胞死亡產(chǎn)生的“原位瘤苗”的量對細胞免疫的刺激強度及改變程度。筆者認為，131I治療與放療類似，不僅是因為輻射產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，還因為激活了機體的抗腫瘤免疫效應(yīng)。

131I治療產(chǎn)生的“原位疫苗”不僅能夠誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)，而且能夠誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。Fallahi等[12]提出，年齡、性別、組織學(xué)類型等因素對131I的治療療效無顯著影響。本研究結(jié)果顯示，年齡、性別不影響抗TC細胞蛋白的抗體滴度。而131I劑量越高，抗TC細胞蛋白抗體滴度的陽性率可能越高。本研究中，清灶組患者多伴有甲狀腺外轉(zhuǎn)移灶，腫瘤病灶越大，131I劑量越大，經(jīng)131I治療后釋放的腫瘤抗原越多，出現(xiàn)效應(yīng)的時間更快，升高的幅度更高，效應(yīng)持續(xù)的時間也更長。這與文獻有相似之處，文獻認為，高劑量組131I治療TC的成功率高于低劑量組，表明131I的治療可通過在適當范圍內(nèi)施加較高劑量來實現(xiàn)更高的成功率[12]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，清灶組和清甲組在131I誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)的差別不大，原因可能是：(1)樣本量不夠?qū)е陆y(tǒng)計學(xué)無差異，(2)從免疫學(xué)角度看，0.5 mg的蛋白抗原即可誘發(fā)免疫反應(yīng)，但清甲組可能存在影像學(xué)(SPECT/CT、彩超等)未發(fā)現(xiàn)的少量TC細胞，故能夠激發(fā)與清灶組(CT上顯示病灶至少需要1 g組織，即109個細胞)相似的抗體產(chǎn)生反應(yīng)，(3)機體是個復(fù)雜的體系，雖然射線能夠刺激機體的免疫反應(yīng)，但是由于輻射對免疫細胞也有一定的殺傷作用，對腫瘤微環(huán)境也有抑制作用，故未呈現(xiàn)明顯的免疫反應(yīng)[13]。

本研究尚存在局限：研究時間短，未采集多個時相的標本，無法分析131I治療后機體完整的免疫應(yīng)答過程；收集的病例數(shù)不多。但沿著本研究開創(chuàng)的方向繼續(xù)深入探討131I治療后的免疫改變，將有助于揭示內(nèi)照射與免疫抗癌的規(guī)律，為將來研究碘難治性TC患者的免疫治療提供理論基礎(chǔ)。