任公卿 綜述 姚 靜審校

（濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院 ，濟寧 272067）

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）和程序性細胞死亡蛋白 1（programmed death-1，PD-1）對 T細胞的免疫反應起著負向調(diào)控作用，CTLA-4和PD-1的抑制劑通過促進T細胞浸潤發(fā)揮作用。通過阻斷人體抗腫瘤反應的抑制信號來增強患者對腫瘤的免疫應答被認為是當前最有希望的新型腫瘤免疫療法。已有研究報道，CTLA-4和PD-1抑制劑的聯(lián)合應用在黑色素瘤、卵巢癌、結腸癌、晚期軟組織肉瘤、淋巴瘤、血管瘤等腫瘤治療中是有效的，對還有一定免疫功能的患者的治療效果尤為明顯。盡管如此，抗CTLA-4與PD-1組合免疫療法應用過程中，如何選擇聯(lián)合用藥的種類和劑量以及應用時機尚需進一步研究。

1 CTLA-4及其抑制劑

CTLA-4是免疫球蛋白超家族的一員，作為一種跨膜糖蛋白，主要定位于細胞內(nèi)囊泡，起負性調(diào)節(jié)作用，在不同類型的非T細胞中均有表達，包括正常細胞和腫瘤細胞，在靜息T細胞中僅有少量表達。初始T細胞中，CTLA-4存儲在細胞內(nèi)，細胞表面上不表達?？乖cT細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）結合后，CTLA-4易位至細胞表面，抑制T細胞活化?？乖蔬f細胞（antigen presenting cell，APC）能夠在腫瘤部位收集嵌入在主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）分子上的抗原肽，還能通過其表面受體（如Cluster of Differentiation 28，CD28）和細胞因子[如白細胞介素interleukin（IL）-12]提供共刺激信號，刺激T細胞活化[1]。T細胞運動增加致使其與APC接觸時間縮短會抑制T細胞增殖，減少細胞因子產(chǎn)生，而CTLA-4能夠增加T細胞運動，阻止TCR誘導的停止信號[2]。CTLA-4能夠促進Casitas B譜系淋巴瘤原癌基因-b的表達，抑制zeta鏈相關蛋白（zeta-associated protein）70的產(chǎn)生，增強T調(diào)節(jié)細胞（T regulatory cell，Treg）的免疫抑制活性。此外，CTLA-4還可以抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶／絲蘇氨酸蛋白激酶通路、細胞周期蛋白D3、細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）／CDK6和核轉錄因子-κB（Nuclear factorkappaB，NF-κB）共同發(fā)揮免疫抑制作用（圖 1）。

叉頭翼狀螺旋轉錄因子（forkhead／winged helix transcription factor p3，F(xiàn)oxp3）是決定Treg細胞分化及功能的關鍵性轉錄調(diào)控蛋白。TCR刺激下，T細胞中Foxp3穩(wěn)定增加 CTLA-4的表達，也就是說CTLA-4是Foxp3的靶基因，其在Treg細胞表面都有基礎性表達，在其他T細胞亞群中也有上調(diào)，尤其是CD4＋T細胞。腫瘤早期，CTLA-4產(chǎn)生抑制信號減少T細胞活化，從而減弱機體的免疫應答。CTLA-4的持續(xù)表達有助于血液系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤的生長。CTLA-4mRNA水平較高的乳腺癌患者有明顯的腋窩淋巴結轉移和更高的臨床分期，尤其對于三陰乳腺癌更具有針對性[3-4]。CTLA-4 mRNA的高表達與慢性淋巴細胞白血病患者的臨床預后密切相關[5]。NSCLC患者CTLA4過度表達，與患者年齡和組織學分化有關[6]。CTLA-4高表達的非小細胞肺癌患者預后比較差，提示CTLA-4可以作為腫瘤免疫治療的潛在靶點[6]。阻斷CTLA-4對增強效應T細胞作用，抑制Treg細胞介導的免疫抑制作用尤其重要。CTLA-4在調(diào)節(jié)免疫反應中有重要作用，是腫瘤免疫靶點。阻斷CTLA-4可以增強抗腫瘤免疫療法[7]。目前，已經(jīng)開發(fā)兩種完全人源化的抗CTLA-4單克隆抗體ipilimumab和曲美莫單抗（tremelimumab）。Ipilimumab是第一種人源抗CTLA-4單克隆抗體（IgG1κ）。在晚期黑色素瘤患者的臨床試驗表明，使用ipilimumab治療后患者的總生存期有顯著改善[8]。與單獨的使用dacarbazin相比，聯(lián)合使用DNA-烷化劑達卡巴嗪（dacarbazin）和ipilimumab，黑素瘤患者的生存率明顯延長[9]。基于以上臨床研究，ipilimumab于 2011年被FDA批準用于治療轉移性黑色素瘤患者。

ipilimumab治療后的黑素瘤患者血液中低乳酸脫氫酶、絕對單核細胞計數(shù)、單核細胞性MDSCs、相對淋巴細胞計數(shù)和Treg細胞數(shù)等都是總生存期的相關因素[10-11]。ipilimumab治療的黑素瘤患者較好的臨床效果與腫瘤組織中高表達的IDO具有一定的相關性。進一步的研究證明，阻斷CTLA-4會導致腫瘤浸潤性CD8＋T細胞數(shù)量顯著增加[11]。ipilimumab治療后腫瘤組織的壞死程度與腫瘤浸潤性CD8＋效應T細胞和Treg細胞的比率的自然對數(shù)呈線性相關，這也證明了ipilimumab可調(diào)節(jié)效應T細胞和Treg細胞的平衡[12]。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和ipilimumab聯(lián)合治療晚期前列腺癌，患者體內(nèi)CD4＋和CD8＋T細胞中人白細胞抗原DR（HLA-DR）和血液循環(huán)中CD1c＋樹突狀細胞的表面標志物 CD40均有所上調(diào)[13]?？笴TLA-4抗體治療的癌癥患者外周血和腫瘤組織中浸潤性誘導型T細胞共刺激分子（inducible T cell costimulator，ICOS）陽性的 1型 T輔助細胞（T Helper 1，Th1）樣 CD4＋T細胞和耗竭樣 CD8＋T細胞都增加，并且ICOS＋CD4＋T細胞的數(shù)量與黑素瘤患者總生存率的改善呈正相關[11]。抗CTLA-4抗體治療的黑素瘤患者血液中CD4＋和CD8＋T細胞中Ki67、ICOS和GATA3的表達均有上調(diào)[14-15]。抗CTLA-4抗體治療的黑素瘤患者外周血T細胞中PD-L1表達可以作為總生存率和無進展生存期的預兆性指標[15]。阻斷 CTLA-4后 TCR多樣性增加，使免疫系統(tǒng)恢復，與總生存率的提高具有一定相關性。血清中高水平的可溶性CD25與抗CTLA-4治療的黑色素瘤患者的臨床效果呈負相關，這說明可溶性CD25可以作為腫瘤細胞對阻斷CTLA-4療法產(chǎn)生耐藥性的一個指標[16]。

抗CTLA-4免疫治療相比傳統(tǒng)腫瘤治療有著很大的優(yōu)勢，值得進一步研究。

2 PD-1及其抑制劑

PD-1是免疫球蛋白超家族的跨膜受體，在T細胞群中均有基礎性表達，在B細胞、骨髓樹突細胞、肥大細胞、朗格漢斯細胞和自然殺傷細胞上也有表達。PD-1主要參與適應性免疫應答調(diào)節(jié)，介導抑制性免疫信號傳遞[1]。程序性細胞死亡配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L）有兩種類型：PD-L1（B7-H1；CD274）和 PD-L2（B7-DC；CD273），兩者均可在APC表面表達。TCR刺激下，CD28促進 Treg細胞活化。干擾早期 TCR／CD28信號傳導和相關的IL-2依賴性正反饋調(diào)節(jié)，PD-1信號傳導會減少細胞因子[如IL-2、干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）]的產(chǎn)生，抑制細胞周期蛋白的表達。見圖1。

圖1 CTLA-4和 PD-1的細胞內(nèi)信號傳導[1，21]

與CTLA-4不同，PD-1主要是調(diào)節(jié)外周組織效應T細胞的免疫應答階段，而不是T細胞活化的初始階段[17]?；罨腡細胞中PD-1表達會上調(diào)，在外周組織中持續(xù)存在。炎癥誘導下，PD-1配體表達也會增加。PD-1信號傳導的活化會抑制T細胞的增殖和細胞因子產(chǎn)生。與CTLA-4相同的是，PD-1可以縮短T細胞與靶細胞之間的接觸時間，抑制TCR介導的停止信號。PD-1信號傳導還可以通過多種靶向抑制T細胞免疫應答的方式調(diào)節(jié)T細胞，這也是腫瘤細胞阻止自身免疫攻擊的機制。在小鼠腫瘤模型中，通過阻斷PD-1或其配體PD-L1的方式可以增強抗腫瘤免疫效應[18]。2010年，人IgG4抗PD-1抗體在多個實體瘤患者中進行了臨床I期試驗[19]，患者治療耐受性和臨床反應良好。進一步臨床試驗顯示，在腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）和膀胱癌等轉移性尿路上皮癌的患者中進行了抗PD-1治療，臨床效果均較好[20]。因此，F(xiàn)DA批準了針對這些適應癥的抗PD-1治療。

抗PD-1治療患者腫瘤組織中浸潤的CD8＋T細胞數(shù)量明顯增多，也就是說CD8＋T細胞數(shù)量可以預測抗PD-1治療的臨床效果?？筆D-1治療后，腫瘤浸潤性B細胞和單核細胞性MDSC的細胞密度都有所減少?；罨哪[瘤浸潤性T淋巴細胞（tumor-infiltrating T-lymphocytes，TILs）能夠識別腫瘤抗原，上調(diào)PD-1的表達和IFN-γ的分泌[19]。另外，腫瘤細胞會增加PD-L1的表達，保護腫瘤細胞不受PD-1＋效應T細胞的攻擊?；谶@些發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達被認為是有活性的抗腫瘤免疫應答的標志物。PD-L1表達在腫瘤細胞和浸潤性免疫細胞中有顯著差異，在黑色素瘤、NSCLC、HCC和RCC中表達量較高[8，22-23]。腫瘤細胞或者腫瘤浸潤性免疫細胞內(nèi)PD-L1表達量與抗PD-1／PD-L1治療效果之間存在相關性，即PD-L1表達越高，治療效率越好。

腫瘤患者的腸道微生物菌群很大程度上影響抗PD-1免疫治療的功效。臨床效果較好的癌癥患者的腸道微生物菌群表現(xiàn)出更高的α多樣性和相對豐富瘤胃菌科細菌[14]。

抗PD-1／PD-L1免疫治療效果及預后都更好，這也為相應的腫瘤治療提供了更多選擇。

3 CTLA-4和PD-1抑制劑在腫瘤治療中的聯(lián)合應用

3．1 聯(lián)合治療的基礎

CTLA-4和PD-1共抑制信號可以抑制浸潤腫瘤的T細胞。聯(lián)合應用PD-1和CTLA-4阻斷劑后，腫瘤組織中CD4＋效應T細胞與Treg細胞比率以及CD8＋T細胞與Treg細胞比率大大增加，并與抗腫瘤的作用效果呈正相關[24]。聯(lián)合治療還可以降低了Treg細胞的數(shù)量，并能通過抑制Treg細胞的功能標志物（如糖皮質激素聯(lián)合誘導的腫瘤壞死因子受體）減弱其功能。2015年10月，F(xiàn)DA批準了PD1抗體Opdivo聯(lián)合CTLA-4抗體Yervoy一線用于晚期惡性黑色素瘤患者，有效率高達50%～60%，而單用PD1抗體的有效率一般只有40%。在PD-1抗體療法主要會觸發(fā)線粒體氧化磷酸化途徑，而CTLA4抗體療法卻能觸發(fā)胞內(nèi)大多數(shù)信號途徑，其中還包括細胞周期調(diào)控途徑，這也是為什么聯(lián)合治療要比單藥治療更有效的原因[25]。

3．2 臨床應用

3.2.1 腎癌 一項入組了1096名患者的Ⅲ期臨床試驗（CheckMate 214）表明，在未經(jīng)治療的晚期腎細胞癌中，Nivolumab和Ipilimumab聯(lián)合治療的總生存率和客觀緩解率顯著高于一線治療方案舒尼替尼[26]。

3.2.2 黑色素瘤 PD1抗體聯(lián)合CTLA-4抗體對于黑色素瘤有較好的療效[27]。在小鼠臨床前實驗同樣發(fā)現(xiàn)，預先植入黑色素瘤細胞的同時注射B16-Flt-3配體（Fvax）和CTLA-4抗體，有10%小鼠會表現(xiàn)出腫瘤抑制；Fvax聯(lián)合PD-1阻斷劑在25%的小鼠中表現(xiàn)出腫瘤抑制效果；聯(lián)合應用CTLA-4和PD-1檢查點阻斷劑會導致50%的實驗動物發(fā)生腫瘤抑制，再另外添加PD-L1阻斷劑后，65%的小鼠顯示出腫瘤抑制[24]。

3.2.3 卵巢癌 抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體聯(lián)合治療卵巢癌可逆轉腫瘤浸潤性淋巴細胞功能障礙并誘導腫瘤消退[28]。將ipilimumab加入檢測點抑制劑nivolumab治療復發(fā)性上皮性卵巢癌，可以提高腫瘤反應和無進展生存危險率的比例。

3.2.4 結直腸癌 基于一項正在開展的Ⅱ期臨床研究CheckMate-142的數(shù)據(jù)，該研究中包括一個Opdivo聯(lián)合Yervoy組合隊列，該隊列入組了119例攜帶DNA錯配修復缺陷或微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定的轉移性結直腸癌患者，Opdivo＋Yervoy治療的客觀緩解率為 49%（95%可信區(qū)間：39～58，n＝58／119），其中完全緩解率為 4.2%（n＝5／119），部分緩解率為 45%（n＝53／119）。

3.2.5 晚期軟組織肉瘤 Ipilimumab聯(lián)合nivolumab治療，對晚期軟組織肉瘤患者的治療效果和耐受性均良好[29]。

3.2.6 不良反應及應對方法 盡管聯(lián)合治療方案的效果和可行性已經(jīng)得到了肯定，但是其產(chǎn)生的不良反應也應加以考慮，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、皮膚瘙癢、關節(jié)炎等，與過度免疫有關[30-32]。聯(lián)合治療的效果較好，但其毒性也會增加。在聯(lián)合治療應用中，阻斷CTLA-4的副作用相對更大，因為腫瘤細胞等靶細胞在被T淋巴細胞殺傷的同時，其它組織器官也會受到不同程度的損傷。有研究得出，對轉移性腎細胞癌患者聯(lián)合應用nivolumab和ipilimumab治療的不良發(fā)生率較低[33]。因此，研究人員正在努力研究抗CTLA-4與其他療法組合的方法或通過適當調(diào)整雙抗法之間的用量比例以減少副作用。例如，在NSCLC患者中使用nivolumab和ipilimumab低劑量組合抑制效果更顯著；在黑色素瘤患者中在給予ipilimumab前加入nivolumab效果更顯著[34]。如何應用抗CTLA-4和PD-1組合療法與其他治療方法聯(lián)合應用也需要進一步探索。羅氏公司的PD-L1聯(lián)合白蛋白紫杉醇的治療方案已被FDA批準用于聯(lián)合治療三陰性乳腺癌；恒瑞PD-1聯(lián)合阿帕替尼在美國開展III期臨床。在靶向治療或新輔助治療的基礎上應用免疫治療用于黑色素瘤較傳統(tǒng)治療來說效果更好[35-36]。另外可將PD-1、CTLA-4與非特異性免疫細胞治療（如LAK療法）[37]、特異性免疫細胞治療（如 CART）[38]、腫瘤疫苗等腫瘤免疫方法聯(lián)合使用。因此，如何找到不良反應和作用效果之間的平衡，找到相應特異標記物對不良反應進行檢測，均需要進一步探索。

4 小結及展望

免疫治療作為充滿前景的治療腫瘤的手段，對于晚期患者的治療效果更好、副作用更小、作用更持久。免疫系統(tǒng)是十分復雜的，不同的人群免疫系統(tǒng)的強弱不同，如何篩選最可能因此受益的適宜人群及預測療效就顯得尤為重要。免疫抑制劑的作用有賴于自身免疫系統(tǒng)，PD-1／PD-L1及 CTLA-4的表達可作為篩選適宜患者的標志物[39]。但是，免疫治療的機制是十分復雜的，只檢測某一種可能的標志物是不夠的。

在常規(guī)的內(nèi)外科治療的基礎上，免疫治療如何作為輔助治療長期應用于臨床，需要進一步的臨床研究。其中一個熱點問題就是，抗CTLA-4和PD-1組合免疫療法與化療及抗血管生成相結合，是否可以實現(xiàn)1＋1＋1＞3的效果。另外，免疫抑制劑如何保存、運輸，以降低成本，也是未來需要考慮的經(jīng)濟方面的問題。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。