代秀松，張知理，王曉盼，陳笑天，葉龍飛，石 彥

慢性骨髓炎是由化膿性細(xì)菌引起的慢性炎癥，常造成骨或周圍軟組織的壞死或破壞。細(xì)菌生物膜的形成是阻礙抗菌類藥物滲透至感染部分，限制抗菌效果的重要原因。當(dāng)細(xì)菌附著于物體表面，能分泌一些細(xì)胞外大分子物質(zhì)，將自身包裹形成一種特殊的內(nèi)部生態(tài)環(huán)境[1]。在壞死的軟骨組織、骨感染微生物后，同樣能在其表面形成一種生物膜。生物膜的存在大大提高了細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抵抗能力，導(dǎo)致細(xì)菌難以徹底清除，最終使慢性骨髓炎反復(fù)發(fā)作、感染[2]。

1994年，美國食品和藥品監(jiān)督管理局首次批準(zhǔn)超聲波作為一種安全、無創(chuàng)的輔助治療手段，應(yīng)用于促進(jìn)新鮮骨折愈合的輔助治療。研究證實(shí)，超聲波對(duì)于骨不連預(yù)后[3]、關(guān)節(jié)退行性疾病[4]的恢復(fù)具有良好的促進(jìn)作用。研究[5]證實(shí)，超聲波能有效殺滅金黃色葡萄球菌并顯著破壞細(xì)菌生物膜[5]。BIGELOW等[6]研究證實(shí)高強(qiáng)度聚集超聲能有效破壞體外大腸桿菌的生物膜結(jié)構(gòu)。超聲波主要原理利用了其空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)殺菌及破壞細(xì)菌生物膜。因此，在慢性骨髓炎治療過程中，是否可以輔助超聲治療，來破損細(xì)菌生物膜，從而到達(dá)抑制細(xì)菌生長，改善慢性骨髓炎局部微環(huán)境，提高臨床治療效果，是值得研究的。

銅綠假單胞桿菌是醫(yī)院感染的主要病原微生物之一，近年來發(fā)現(xiàn)因其感染的比例呈上升趨勢，繼金黃色葡萄球菌之后排在第二位，備受研究人員的廣泛關(guān)注。研究[7]證實(shí)，細(xì)菌生物膜的形成是導(dǎo)致銅綠假單胞桿菌耐藥的關(guān)鍵原因，在抵抗抗生素發(fā)揮抗菌作用過程中扮演重要作用。

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是基于現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究基礎(chǔ)對(duì)生物神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行數(shù)學(xué)抽象、簡化和模仿而逐步發(fā)展起來的一種新型信息處理和計(jì)算系統(tǒng)[8]。相比響應(yīng)面分析，能克服響應(yīng)面分析法中二次多項(xiàng)式的一些局限性，更全面地反映參數(shù)與輸出結(jié)果的關(guān)系[9]。因此，本研究預(yù)通過銅綠假單胞桿菌感染誘導(dǎo)慢性骨髓炎模型，研究超聲波對(duì)銅綠假單胞桿菌的抑菌作用，以細(xì)菌膜抑菌數(shù)為指標(biāo)，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化超聲波滅菌參數(shù)，并應(yīng)用于輔助治療銅綠假單胞桿菌誘導(dǎo)的兔慢性骨髓炎模型動(dòng)物，從抑菌角度評(píng)價(jià)超聲波輔助治療慢性骨髓炎的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 銅綠假單胞桿菌(ATCC9072)購買于廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年新西蘭兔40只，普通級(jí)，來源于蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，自由飲水，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，飼養(yǎng)環(huán)境濕度45%～65%，溫度25 ℃左右。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引導(dǎo)玻片法建立體外模型[10]將銅綠假單胞桿菌接種于胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB肉湯)中，培養(yǎng)24 h，收集銅綠假單胞桿菌，采用液體TSB培養(yǎng)基懸浮細(xì)菌，并調(diào)節(jié)細(xì)菌的濃度為106cfu/mL，備用。取1個(gè)三角瓶，加入TSB培養(yǎng)基，然后再放入一蓋玻片，取100 μL上述106cfu/mL的菌懸液于三角瓶中，然后將三角瓶放入恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后，取出蓋玻片，采用無菌0.9%氯化鈉溶液漂洗，去除浮游菌，觀察貼壁生長細(xì)菌數(shù)。

1.3.2 活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù) 將0.9%氯化鈉溶液漂洗的載玻片放置于-20 ℃ 0.9%氯化鈉溶液中，超聲波震蕩，功率180 W，時(shí)間1.5 min，使貼壁的細(xì)菌脫落進(jìn)入0.9%氯化鈉溶液中，然后取0.1 mL的菌懸液涂布于營養(yǎng)瓊脂平皿中，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算平板菌落數(shù)。通過菌落數(shù)的水平評(píng)價(jià)生物膜生長狀況。膜片菌落數(shù)=(肉眼可計(jì)菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/膜片體積。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以超聲強(qiáng)度(X1)，頻率為(X2)、處理時(shí)間(X3)為主變量因素，以膜片菌落數(shù)為響應(yīng)變量。采用Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采集數(shù)據(jù)，因素水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

超聲處理：將預(yù)超聲的蓋玻片浸入盛有脫氣水的密閉容器中，在超聲儀的治療頭涂布耦合劑，然后進(jìn)行超聲輻照。所有超聲處理按工作時(shí)間1 s，間隙1 s處理。

1.3.4 兔股骨慢性骨髓炎模型構(gòu)建[11]取新西蘭兔，按1 mL/kg劑量向兔大腿肌肉注射3%的戊巴比妥，麻醉兔子，然后左側(cè)臥位固定，消毒后，在股骨大轉(zhuǎn)子下2 cm為切口起點(diǎn)，沿股骨方向做縱行切口1 cm，切開皮膚，逐層分離皮下筋膜肌肉，剝離局部骨膜后用3.5 mm鉆頭的電鉆，在該處鉆2個(gè)縱向相連、部分重疊的骨洞，直達(dá)髓腔，制成一個(gè)矩形骨窗，孔洞用無菌骨蠟密封。先用注射器抽取骨髓后，再向髓腔內(nèi)注射0.1 mL的 5%魚肝油酸鈉，后再向髓腔內(nèi)注射0.5 mL的銅綠假單胞菌菌液(1×106cfu/mL)。之后逐層縫合皮膚軟組織，無菌敷料覆蓋包扎，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)4周。

1.3.5 分組及處理 將兔股骨慢性骨髓炎模型構(gòu)建成功的新西蘭兔分為4組，分別為對(duì)照組、阿奇霉素組、超聲波處理組及超聲波處理+阿奇霉素協(xié)同作用組。手術(shù)前1周每天采用阿奇霉素和超聲波治療1次，第2周后每3 d采用阿奇霉素和超聲波治療1次，連續(xù)養(yǎng)4周后，從傷口部取分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，并對(duì)骨髓炎狀況進(jìn)行評(píng)分。

1.3.6 骨髓炎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 采用Norden評(píng)分法評(píng)價(jià)骨髓炎狀況，Norden骨髓炎評(píng)分法包含4個(gè)指標(biāo)：死骨形成(有為3 分，可疑為1.5分，無為0分)；骨質(zhì)破壞(有為2分，可疑為1分，無為0分)；骨質(zhì)增生(有為1分，可疑為0.5分，無為0分)；軟組織炎性包塊影(有為1分，可疑為0.5分，無為0分)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析不同分組間的差異性，采用JMP軟件進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化超聲波抑菌參數(shù)

2.1.1 數(shù)據(jù)的采集 采用Box-behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ近c(diǎn)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)(見表2)。

表2 Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.2 隱藏節(jié)點(diǎn)的確定 隱藏節(jié)點(diǎn)的確定在保證神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的準(zhǔn)確性方面具有重要作用，隱藏節(jié)點(diǎn)過少常導(dǎo)致擬合不足，過多則導(dǎo)致擬合過多，因此需確定合適的隱藏節(jié)點(diǎn)。本研究將確定交叉驗(yàn)證組K為5的情況下，通過2～8個(gè)隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行模擬訓(xùn)練，每次訓(xùn)練重復(fù)5次，根據(jù)模擬訓(xùn)練得到的決定系數(shù)R2及交叉驗(yàn)證R2值來確定隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)，模擬訓(xùn)練結(jié)果見圖1。

相關(guān)系數(shù)R2隨著隱藏節(jié)點(diǎn)的增加而增加，并趨向平穩(wěn)接近1。交叉驗(yàn)證R2隨著隱藏節(jié)點(diǎn)的增加，先上升后下降并趨向平穩(wěn)，在隱藏節(jié)點(diǎn)為4時(shí)，交叉驗(yàn)證R2最大，說明此節(jié)點(diǎn)為4時(shí)，擬合最優(yōu)。因此本研究采用3×4×1結(jié)構(gòu)的三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(見圖2)，3個(gè)神經(jīng)元分別代表超聲強(qiáng)度X1、頻率X2及處理時(shí)間X3，另包含4個(gè)隱藏層神經(jīng)元和1個(gè)輸出神經(jīng)元，輸出神經(jīng)元為膜片菌落數(shù)(Y值)。其他參數(shù)值，過擬合項(xiàng)0.001、歷程數(shù)20，最大迭代數(shù)50，收斂準(zhǔn)則0.000 01。通過上述參數(shù)擬合測得實(shí)際值和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值之間具有非常好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到了0.99，說明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型有較好的擬合效果(見圖3)。

2.1.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化操作參數(shù) 本研究在確定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的隱藏節(jié)點(diǎn)后，可通過曲面刻畫器來觀察超聲強(qiáng)度、超聲頻率及超聲時(shí)間對(duì)膜片菌落數(shù)的影響趨勢，首先固定其中一個(gè)變量，然后觀察兩個(gè)變量的曲面變化趨勢，結(jié)果見圖4。

超聲強(qiáng)度與超聲頻率對(duì)膜片菌落數(shù)影響，結(jié)果顯示,超聲強(qiáng)度40 W/cm2后，膜片菌落數(shù)變化趨于穩(wěn)定；超聲頻率隨著頻率增加，膜片菌落數(shù)降低；超聲頻率受強(qiáng)度的影響較大，強(qiáng)度越大，超聲頻率越高，兩者協(xié)同效果越好(見圖4A)。超聲頻率與超聲時(shí)間對(duì)膜片菌落數(shù)的影響，結(jié)果顯示，超聲時(shí)間受超聲強(qiáng)度的影響，隨著強(qiáng)度增加，超聲時(shí)間越長效果越明顯，在超聲前10 min，變化較緩，10 min后膜片菌落數(shù)下降較快(見圖4B)。聲頻率與超聲時(shí)間對(duì)膜片菌落數(shù)的影響，結(jié)果顯示，隨超聲頻率增加，膜片菌落數(shù)快速下降，超聲時(shí)間受超聲頻率影響，隨超聲頻率增加，超聲時(shí)間對(duì)膜片菌落數(shù)影響更明顯(見圖4C)。

根據(jù)超聲強(qiáng)度、超聲頻率及超聲時(shí)間對(duì)膜片菌落數(shù)影響的規(guī)律，利用JMP軟件預(yù)測刻畫器優(yōu)化超聲波破壞細(xì)菌膜的處理參數(shù)，結(jié)果顯示，當(dāng)超聲強(qiáng)度為39.95 W/cm2(取整數(shù)40 W/cm2)、超聲頻率為60 kHz，超聲時(shí)間為15 min時(shí)，膜片菌落數(shù)最低，達(dá)19.82 cfu/cm3(見圖5)，因此，以此參數(shù)作為最優(yōu)超聲條件。在此條件下，本研究繼續(xù)重復(fù)了3次平行實(shí)驗(yàn)，其菌落膜片數(shù)平均值為20.33，與預(yù)測值之間沒有明顯的差異，說明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有較好的預(yù)測功能。

2.2 超聲應(yīng)用于兔股骨慢性骨髓炎治療效果評(píng)價(jià)2.2.1 微生物感染情況分析 采用細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)觀察兔股骨中微生物感染情況，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組兔的股骨髓中均檢測到銅綠假單胞桿菌，超聲波組有8只檢測到銅綠假單胞桿菌，阿奇霉素處理組有4只檢測到銅綠假單胞桿菌，超聲波加阿奇霉素處理組均未檢測到銅綠假單胞桿菌。

2.2.2 Norden評(píng)分 通過Norden評(píng)分對(duì)各組兔股骨慢性骨髓炎狀況進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示，對(duì)照組Norden評(píng)分最高，所有兔評(píng)分均>4。雖然2組Norden評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是Norden評(píng)分有下降趨勢，且部分兔恢復(fù)效果較好，一半以上Norden評(píng)分≤4。超聲協(xié)同阿奇霉素處理組效果最佳，Norden評(píng)分與對(duì)照組有明顯的差異性，且總體恢復(fù)效果較好，有2只呈現(xiàn)完全恢復(fù)狀況(見表3)。

表3 各組兔Nordon評(píng)分比較分)

3 討論

細(xì)菌生物膜的形成是影響慢性骨髓炎治療的關(guān)鍵原因。為了體外探究超聲波對(duì)細(xì)菌生物膜的影響，本研究采用了一種引導(dǎo)片法，該方法可直接觀察生物膜的形成情況，另外通過超聲震蕩-活菌計(jì)算評(píng)價(jià)生物膜形成情況，結(jié)果穩(wěn)定可靠[12]?；诖朔椒ǎ狙芯客ㄟ^神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型探究了超聲強(qiáng)度、超聲頻率及超聲時(shí)間對(duì)引導(dǎo)片法生物膜形成的影響，通過觀察膜片菌落數(shù)反映生物膜破壞程度，膜片菌落數(shù)越少，生物膜破壞越嚴(yán)重。研究結(jié)果顯示超聲波的超聲強(qiáng)度、超聲頻率及超聲時(shí)間均影響生物膜的形成，呈協(xié)助作用，當(dāng)超聲強(qiáng)度越大時(shí)，超聲頻率和超聲時(shí)間對(duì)細(xì)菌生物膜破壞越大，同樣超聲頻率越大，超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間對(duì)生物膜破壞越大。這符合超聲波滅菌理論。本研究最終確定的最優(yōu)參數(shù)條件為：超聲強(qiáng)度為40 W/cm3、超聲頻率為60 kHz、超聲時(shí)間為15 min時(shí)，膜片菌落數(shù)最少，生物膜破壞最嚴(yán)重。

另外，進(jìn)一步將超聲波應(yīng)用于兔股骨慢性骨髓炎模型的治療。研究發(fā)現(xiàn)，超聲波有一定的抑菌作用，但治療效果并不佳，Norden評(píng)分及微生物感染兔仍較高。但是，當(dāng)超聲波與抗生素阿奇霉素協(xié)同治療兔股骨慢性骨髓炎，表現(xiàn)為較好的治療效果，在微生物感染或Norden評(píng)分方面均取得了較好的效果。這與臨床文獻(xiàn)[13]報(bào)道效果相一致，超聲波應(yīng)用于慢性骨髓炎病人的輔助治療可以改善病人的生活質(zhì)量，提高病人活動(dòng)能力[13]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，超聲波輔助治療效果主要是通過其空化現(xiàn)象和機(jī)械效應(yīng)發(fā)揮作用，超聲波的空化過程中產(chǎn)生微泡，微泡的震動(dòng)能產(chǎn)生剪切力和微射流，促進(jìn)小分子物穿過細(xì)胞膜或界膜等結(jié)構(gòu)，發(fā)揮作用。或許說明了超聲波與抗生素協(xié)同效果較好的關(guān)鍵原因。

綜上，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可較好的優(yōu)化超聲波的滅菌參數(shù)，有效地預(yù)測及驗(yàn)證了超聲波滅菌的最佳參數(shù)。另外，證實(shí)超聲波應(yīng)用于慢性骨髓炎的治療，單獨(dú)作用效果有限，聯(lián)合抗生素治療效果更佳。