華湘黔，周建華

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于女性惡性腫瘤首位[1]，其中最常見的是浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。近年來，雖然乳腺癌的綜合治療有了較大的進(jìn)展，但其侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致病人死亡的重要原因之一。HMGB1于1973年由Ernest Johns在牛胸腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)該蛋白在聚丙烯酰胺凝膠中的高遷移率的特性從而命名為“high-mobility group”(HMG)proteins[2-3]。HMGB1分布廣泛,在肝、心、脾、肺、腎及淋巴組織都有發(fā)現(xiàn),除肝、腦組織主要存在于細(xì)胞外,在大多數(shù)組織HMGB1存在于細(xì)胞核內(nèi)[4]。HMGB1是一種真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，在多種生物學(xué)過程中均發(fā)揮重要作用，如在細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA重組和修復(fù)、維持和穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)，而在細(xì)胞核外其參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化、增殖、遷移等[5-6]。有研究[7]表明，腫瘤進(jìn)展和遷移的重要過程之一是細(xì)胞外基質(zhì)被基質(zhì)金屬蛋白酶降解的過程，而HMGB1能夠結(jié)合纖溶酶原系統(tǒng)，提高基質(zhì)金屬蛋白酶活性，從而加速腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和遷移。同時(shí)，HMGB1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。然而，HMGB1的表達(dá)水平在不同類型腫瘤組織中存在差異，且發(fā)揮的作用也不同。

乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展是由多個(gè)因子參與的復(fù)雜過程，病人因其死亡的主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移造成臨近器官組織和全身各系統(tǒng)的變化。因此，采取合適的方式阻止乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移將會(huì)給病人帶來極大的價(jià)值。HMGB1在乳腺癌中的研究報(bào)道少見，我們對(duì)139例女性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病人術(shù)后組織的HMGB1表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，并觀察其亞細(xì)胞定位情況，分析了其與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)作報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2014年6月我院收治的139例女性乳腺非特殊型浸潤(rùn)性癌病人的臨床病理資料，年齡30～62歲，中位年齡53歲。按2012年WHO乳腺腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各病例進(jìn)行分型和分級(jí)。所有病人術(shù)前均未做化療、免疫及放射治療。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HMGB1的表達(dá) 所有組織均以3.7%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，3～4 μm連續(xù)切片。免疫組織化學(xué)染色簡(jiǎn)要步驟如下：枸櫞酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)，兔抗人HMGB1單克隆一抗(克隆號(hào)：EPR3507，Abcam公司)以1∶100稀釋比例滴加，室溫孵育60 min(37 ℃)，0.3% H2O2室溫孵育10 min，之后用二抗(EnVision二步法試劑盒，Dako公司)室溫孵育30 min(37 ℃)，最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色3～5 min，蘇木精對(duì)比染色、脫水、封片。

HMGB1蛋白陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核，出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒，部分病例細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外也可見著色。本研究中，根據(jù)FROMOWITZ等[10]方法，高倍視野(200倍)觀察10個(gè)表達(dá)明顯的區(qū)域，細(xì)胞核表達(dá)強(qiáng)度由染色深度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比共同評(píng)分，染色深度計(jì)分0(無染色)、1(淡黃色)、2(棕黃色)、3(棕褐色)，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比按≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分別計(jì)0、1、2、3、4分，二者相加≥4分為高表達(dá)，2～3分為中表達(dá)，1分為低表達(dá)，0分為陰性(不表達(dá))；細(xì)胞質(zhì)表達(dá)情況由≥10%細(xì)胞質(zhì)棕黃色染色定義為陽(yáng)性，低于此標(biāo)準(zhǔn)則為陰性。

1.3 隨訪 病人在手術(shù)結(jié)束后進(jìn)入隨訪，每半年電話隨訪1次，建議其到醫(yī)院做相關(guān)檢查，通過臨床或病理診斷,了解病人生存狀況以及是否有復(fù)發(fā)情況，若病人死亡隨訪終止。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)、logistic回歸分析、Kaplan-Meier生存分析、Log-rank檢驗(yàn)法和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1的表達(dá) HMGB1在乳腺癌組織中細(xì)胞核高表達(dá)率80.58%(112/139)高于癌旁正常乳腺組織中細(xì)胞核高表達(dá)率46.04%(64/139))(χ2=35.68，P<0.01)，細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)率16.55%(23/139)也高于癌旁正常組織的表達(dá)率0(0/139)(χ2=23.32，P<0.01)(見圖1)。HMGB1細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)均可見細(xì)胞核著色，其中19例同時(shí)細(xì)胞核高表達(dá)，表達(dá)率為82.61%(19/23)與細(xì)胞質(zhì)陰性者的細(xì)胞核高表達(dá)率80.17%(93/116)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.07，P>0.05)。

2.2 HMGB1表達(dá)與臨床病例特征的相關(guān)性 HMGB1在組織學(xué)高級(jí)別、雌激素受體陰性、孕激素受體陰性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性率更高(P<0.05)，細(xì)胞核高表達(dá)率在組織學(xué)高級(jí)別乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中更高(P<0.05)(見表1)。logistic回歸分析顯示，腫瘤組織學(xué)分級(jí)是HMGB1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中細(xì)胞核高表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因素(OR=2.197，95%CI= 1.066～4.450，P<0.05)。HMGB1細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因素包括腫瘤組織學(xué)分級(jí)(OR=3.028，95%CI=1.583～5.736，P<0.01)、雌激素受體表達(dá)情況(OR=0.133，95%CI=0.040～0.501，P<0.01)及TNM分期(OR=3.817，95%CI=1.038～14.010，P<0.05)。

表1 乳腺癌病人不同臨床病理特征下HMGB1表達(dá)情況[n；百分率(%)]

續(xù)表1

2.3 HMGB1表達(dá)與乳腺癌病人預(yù)后的關(guān)系 139例乳腺癌病人均獲得完整隨訪，隨訪時(shí)間為66.5(18～75)個(gè)月。139例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病人中，5年總生存率為88.49%(123/139)，5年無復(fù)發(fā)生存率為77.70%(108/139)。

HMGB1細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性乳腺癌病人的5年平均生存時(shí)間為54個(gè)月，總生存率為78.26%(18/23)，HMGB1細(xì)胞質(zhì)陰性乳腺癌病人的5年平均生存時(shí)間為58個(gè)月，總生存率為90.52%(105/116)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.83,P>0.05)(見圖2A)。HMGB1細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性乳腺癌病人的5年平均無復(fù)發(fā)生存期為47.5個(gè)月，無復(fù)發(fā)生存率為65.22%(15/23)，HMGB1細(xì)胞質(zhì)陰性乳腺癌病人的5年平均無復(fù)發(fā)生存期為54.5個(gè)月，無復(fù)發(fā)生存率為80.17%(93/116)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.47,P>0.05)(見圖2B)。

HMGB1細(xì)胞核陽(yáng)性乳腺癌病人的5年平均生存時(shí)間為56.7個(gè)月，總生存率為86.61%(97/112)，HMGB1細(xì)胞核陰性乳腺癌病人的5年平均生存期為59.9個(gè)月，總生存率為96.30%(26/27)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.00，P>0.05)(見圖2C)。HMGB1細(xì)胞核陽(yáng)性乳腺癌病人的5年平均無復(fù)發(fā)生存時(shí)間為52.3個(gè)月，無復(fù)發(fā)生存率為73.21%(82/112)，HMGB1細(xì)胞核陰性乳腺癌病人的5年平均無復(fù)發(fā)生存期為59.2個(gè)月，無復(fù)發(fā)生存率為96.30%(26/27)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.69，P<0.05)(見圖2D)。

3 討論

HMGB1是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中快速遷移而得名。研究[11]發(fā)現(xiàn)，HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)及核外發(fā)揮不同的生物學(xué)功能：其在細(xì)胞核內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA重組和修復(fù)、維持和穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞核外參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化、增殖、遷移等。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核HMGB1可通過主動(dòng)分泌和被動(dòng)釋放等形式到胞外，其主動(dòng)分泌需細(xì)胞核HMGB1經(jīng)乙?；?、磷酸化等轉(zhuǎn)錄后修飾，然后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)入分泌性溶酶體中以出胞方式分泌至胞外[12]。HMGB1的亞細(xì)胞定位和表達(dá)水平在不同類型細(xì)胞和組織中存在較大差異[13]。目前，關(guān)于乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中HMGB1亞細(xì)胞定位和表達(dá)情況，及其臨床意義的研究少見，因此，為進(jìn)一步探討這些問題，我們檢測(cè)139例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中HMGB1的表達(dá)并觀察其亞細(xì)胞定位情況，分析其與預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步分析不同亞細(xì)胞部位的HMGB1蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均可見HMGB1表達(dá)，其中細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性率為16.5%，而在癌旁正常組織中未見細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。HMGB1細(xì)胞核高表達(dá)率和細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性率均顯著高于癌旁正常組織，提示HMGB1可能在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌發(fā)生過程中發(fā)揮了作用。在HMGB1細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病人中，均可見細(xì)胞核著色，其中19例細(xì)胞核高表達(dá)。另外，在細(xì)胞質(zhì)陰性乳腺癌病人中HMGB1細(xì)胞核高表達(dá)率為80.2%，與細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性者無顯著差異。這些結(jié)果提示HMGB1主要定位于乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞核，且細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞核HMGB1著色并無明顯減弱?？赡茉?yàn)槿橄侔┲蠬MGB1雖然存在細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，但其程度較弱，并不影響細(xì)胞核HMGB1表達(dá)的評(píng)分。另外有研究[14-15]在結(jié)直腸癌中觀察到HMGB1細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性者，其在細(xì)胞核中表達(dá)顯著下降，在免疫組織化學(xué)染色的切片中可觀察到明顯的核質(zhì)轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。提示HMGB1在不同腫瘤病種中核質(zhì)轉(zhuǎn)位程度不同，具有不同的表達(dá)和定位模式。

本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)的HMGB1表達(dá)均與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病人多項(xiàng)預(yù)后不良指標(biāo)相關(guān)，包括更高的組織學(xué)分級(jí)、雌激素受體陰性、孕激素受體陰性。表明細(xì)胞質(zhì)的HMGB1與乳腺癌進(jìn)展密切相關(guān)，其可能與雌激素受體或孕激素受體信號(hào)通路之間存在關(guān)聯(lián)。另外，年齡較小(<36歲)的乳腺癌病人細(xì)胞質(zhì)HMGB1蛋白表達(dá)較其他病人增強(qiáng)，提示年輕乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病人具有較為活躍的HMGB1核質(zhì)轉(zhuǎn)位。多因素分析顯示：與HMGB1蛋白細(xì)胞核高表達(dá)相關(guān)的獨(dú)立因素為腫瘤組織學(xué)分級(jí)，而與細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)的獨(dú)立因素包括腫瘤組織學(xué)分級(jí)、雌激素受體和TNM分期，因此，我們認(rèn)為在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，評(píng)估細(xì)胞質(zhì)HMGB1表達(dá)比評(píng)估其細(xì)胞核表達(dá)更具有臨床指導(dǎo)意義。生存分析顯示HMGB1蛋白細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性病人5年總生存率和5年無復(fù)發(fā)生存率均低于細(xì)胞質(zhì)陰性者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于在本組隨訪資料中HMGB1細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性組樣本數(shù)較少的原因，故今后有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步分析。