漆紅蘭，李佳妮，張成孝

陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，西安 710062

檢出限(Limit of Detection，LOD)和靈敏度(Sensitivity，S)是評(píng)價(jià)分析方法的兩個(gè)重要指標(biāo)。國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)等對(duì)檢出限和靈敏度推薦了明確的定義[1]。但是，有些教材和學(xué)術(shù)論文中檢出限和靈敏度的使用仍然較為混亂。例如，檢出限、檢測(cè)限、定量限及測(cè)定限等均有使用；一些論文用檢出限低表明分析方法的靈敏度高。對(duì)檢出限和靈敏度及其關(guān)系和影響因素已有討論[2–8]，但卻多限于特定的方法[4–8]。因此，本文擬歸納檢出限和靈敏度的定義和計(jì)算方法，探討現(xiàn)代分析方法檢出限和靈敏度的影響因素以及降低檢出限和提高靈敏度的一些策略，拋磚引玉，共同商討，以準(zhǔn)確理解分析方法的檢出限和靈敏度的概念和影響因素。

1 檢出限和靈敏度的定義與計(jì)算

1.1 檢出限和靈敏度的定義

1975年，國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)[1]對(duì)檢出限和靈敏度推薦定義為：“The Sensitivity,Si, is defined as the slope of the analytical calibration curve. The Limit of Detection, expressed as the concentration,cL, or the quantify,qL,is derived from the smallest measure,xL, that can be detected with reasonable certainty for a given analytical procedure.”絕大多數(shù)分析化學(xué)教材均采用該定義。但是，在用詞上存在細(xì)微差別。例如，武漢大學(xué)主編的《分析化學(xué)》(第五版)[9]中指出“儀器或分析方法靈敏度是區(qū)別具有微小濃度差異分析物能力的度量；檢出限(detection limit)又稱檢出下限或最低檢出量等，定義為一定置信水平下檢出分析物或組分的最小量或最低濃度?！比A中師范大學(xué)等主編的《分析化學(xué)》(第四版)[10]中指出“被測(cè)物質(zhì)單位濃度或單位質(zhì)量的變化引起響應(yīng)信號(hào)值變化的程度，稱之為方法的靈敏度(sensitivity)；某一方法在給定置信水平上能夠檢出被測(cè)物質(zhì)的最小濃度或最小質(zhì)量稱為這種方法對(duì)該物質(zhì)的檢出限(detection limit)?！比珖?guó)科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會(huì)(原稱“全國(guó)自然科學(xué)名詞審定委員會(huì)”)發(fā)行的《化學(xué)名詞》(第二版)[11]推薦：“靈敏度是被測(cè)組分的量或濃度改變1個(gè)單位時(shí)分析信號(hào)的變化量?！边M(jìn)一步指出“在儀器分析中，分析靈敏度直接依賴于檢測(cè)器的靈敏度與儀器的放大倍數(shù)。由于靈敏度未能考慮到測(cè)量噪聲的影響，現(xiàn)在已不用靈敏度來(lái)表征分析方法的最大檢出能力，而推薦用檢出限來(lái)表征?！?/p>

在建立一種新分析方法或?qū)嶋H測(cè)定時(shí)，通常需要繪制一個(gè)分析信號(hào)y(縱坐標(biāo))隨標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度c或質(zhì)量q(橫坐標(biāo))的變化曲線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上有一段線性部分，靈敏度即為“標(biāo)準(zhǔn)曲線線性部分的斜率”，用線性部分對(duì)應(yīng)的Δy/Δc(或Δy/Δq)來(lái)表示靈敏度S。

檢出限為使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷信號(hào)能顯著區(qū)別于空白信號(hào)的最小信號(hào)值對(duì)應(yīng)的最小濃度(或最小質(zhì)量)。用更容易理解的一句話說(shuō)，檢出限就是某方法有一定的把握估計(jì)能檢出某組分的最小濃度(或最小質(zhì)量)。

1.2 檢出限的計(jì)算

用濃度或質(zhì)量分別定義LOD為：

則LOD的計(jì)算式為：

筆者將對(duì)檢出限的計(jì)算參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的討論。

1.2.1 測(cè)量次數(shù)n

1.2.2 置信因子k

置信因子k的選擇與數(shù)據(jù)服從的分布規(guī)律和置信度的確定相關(guān)。當(dāng)測(cè)量數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時(shí)，k= 3對(duì)應(yīng)的置信度為99.6%；而當(dāng)測(cè)量次數(shù)有限且數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時(shí)，k= 3對(duì)應(yīng)的置信度大約為90%[1]。

如果測(cè)量數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，也可以從統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)理解檢出限。如圖1所示[12]，依據(jù)Currie建議[13]，先確定一個(gè)臨界值(Critical value，LC)，在該值的基礎(chǔ)上再確定檢出限(Detection limit，LD)。臨界值是人為設(shè)定的判斷待測(cè)組分是否存在的標(biāo)準(zhǔn)，檢出限是實(shí)際中能可靠檢出的最小信號(hào)或最小濃度。假設(shè)低濃度范圍內(nèi)測(cè)量信號(hào)服從正態(tài)分布且標(biāo)準(zhǔn)偏差為常數(shù)，設(shè)定α(“實(shí)際不存在但誤判為存在”的概率) =β(“實(shí)際存在但誤判為不存在”的概率) = 5%，則k= 3.29[13]。

圖1 假設(shè)檢驗(yàn)法確定檢出限[12]

如果測(cè)量數(shù)據(jù)服從t分布，即少量測(cè)量次數(shù)數(shù)據(jù)的分布規(guī)律，我們可以從統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)理解最小可鑒別的檢測(cè)信號(hào)ymin與置信因子k、置信度P和平行測(cè)定次數(shù)n之間的關(guān)系，進(jìn)而深入理解檢出限。如果假設(shè)k=tP,f/n1/2，式1可轉(zhuǎn)換為式6：

tP,f為統(tǒng)計(jì)量tP,f值表(雙邊)[10]查得的數(shù)值，f=n? 1。由式6可知，在空白信號(hào)和空白信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差一定的情況下，tP,f/n1/2值越大，則檢出限越高。一般來(lái)說(shuō)，在測(cè)定次數(shù)n相同條件下，P越高，tP,f就越大，則tP,f/n1/2值就越大。例如：t90%,2= 2.92，則tP,f/n1/2= 1.68；t95%,2= 4.30，則tP,f/n1/2= 2.48；當(dāng)t99%,2= 9.92，則tP,f/n1/2= 5.73。在置信度P相同條件下，n越大，tP,f越小，則tP,f/n1/2值越小。例如：t99%,2= 9.92，則tP,f/n1/2= 5.73；當(dāng)t99%,4= 4.60，則tP,f/n1/2= 2.06；當(dāng)t99%,6= 3.71，則tP,f/n1/2= 1.42。在一般評(píng)價(jià)新方法時(shí)，通常選擇k= 3。

1.2.3 靈敏度S

在化學(xué)測(cè)量中，測(cè)量所獲信號(hào)y與濃度c的關(guān)系即標(biāo)準(zhǔn)曲線一般呈S型，如圖2所示。為了便于理解，在該曲線分別標(biāo)注A、B、C、D、E點(diǎn)，即標(biāo)準(zhǔn)曲線由AB、BC、CD、DE四段組成。LOD介于AB段；CD段為一般所稱的線性范圍。如果用S1、S2分別表示BC、CD段的斜率。從式4可知，k和sb一定的情況下，Sc越大，則LODc就越小。由式1可知，ymin為空白信號(hào)平均值與ksb之和。從圖2左下角可以看出，ymin與S2對(duì)應(yīng)的LOD2和ymin與S1對(duì)應(yīng)的LOD1，因?yàn)镾2>S1，則LOD2＜ LOD1。有些人用檢出限低表示靈敏度高，這并不一定正確，因?yàn)闄z出限還與空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差相關(guān)。一般認(rèn)為L(zhǎng)OD為線性范圍下限的1/2–1/3比較可信。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用于剖析檢出限和靈敏度關(guān)系的示意圖

若測(cè)量信號(hào)與濃度的對(duì)數(shù)lgc成正比，此時(shí)檢出限又該如何計(jì)算呢？電位分析法就是一個(gè)典型的例子。Dillingham等人提出了一個(gè)與IUPAC推薦相一致的檢出限計(jì)算方法[14]。他們使用離子選擇性電極的電位方程，E=E?+β1log(a+β2) +ε，推導(dǎo)出計(jì)算離子選擇性電極法的LOD計(jì)算式為：

式7中，β1為與溫度及待測(cè)離子電荷數(shù)有關(guān)的斜率參數(shù)，β2為與干擾離子的活度、選擇性、化合價(jià)有關(guān)的參數(shù)，σ是空白信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，a和β為假陽(yáng)性率和假陰性率，zα，zβ分別為與a和β相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的參數(shù)，即為與置信度相關(guān)的置信因子。

2 檢出限、定量限及測(cè)定限的區(qū)別

本文擬就分析化學(xué)中幾個(gè)中文名詞與英文名詞物理含義給予解釋。全國(guó)自然科學(xué)名詞審定委員會(huì)定義，測(cè)定(Determination)是借助儀器等獲得某一物質(zhì)的物理或化學(xué)特征數(shù)據(jù)的方法[15]。檢測(cè)(Detection)是用特殊裝置特定的方法對(duì)不能直接觀測(cè)的目標(biāo)或現(xiàn)象進(jìn)行觀察和評(píng)價(jià)的方法[16]。鑒定(Identification)是對(duì)試樣中某種組分的鑒別和確定的過(guò)程[11]。測(cè)量(Measurement)是通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得并可合理賦予某量一個(gè)或多個(gè)量值的過(guò)程[17]。筆者認(rèn)為，測(cè)定(Determination)側(cè)重表達(dá)定量分析的概念；定量(Quantification)也側(cè)重表達(dá)定量分析的概念；檢測(cè)(Detection)側(cè)重表達(dá)定性分析的概念；鑒定(Identification)側(cè)重表達(dá)識(shí)別的概念；測(cè)量(Measurement)是按照某種規(guī)律，用數(shù)據(jù)來(lái)描述觀察到的現(xiàn)象，即對(duì)事物做出量化描述。

定量限(Limit of Quantification，LOQ)與檢出限(LOD)為兩個(gè)不同的參數(shù)。全國(guó)自然科學(xué)名詞審定委員會(huì)發(fā)行的《化學(xué)名詞》(第二版)推薦[11]，定量限為“根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理給出的用于估算能定量測(cè)定分析物的最小含量或濃度。若樣品中存在的分析物的量大于該量值，則可認(rèn)為該樣品可以某一相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差被定量測(cè)定。在誤差分布遵從正態(tài)分布的條件下，以適當(dāng)?shù)闹眯鸥怕?95%)被定量測(cè)定的最小含量或濃度。”Currie建議[13]，“Quantification limits are defined in terms of a specified value for the relative standard deviation”。美國(guó)化學(xué)會(huì)環(huán)境改善委員會(huì)(ACS Committee On Environmental Improvement)建議[18]，LOD =Sb+ 3σ，LOQ =Sb+ 10σ，其中Sb是空白信號(hào)測(cè)量的平均值，σ是空白信號(hào)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3將濃度劃分為三個(gè)區(qū)域，理解LOD和LOQ的區(qū)別。若實(shí)際濃度小于LOD，則認(rèn)為“未檢出”；若實(shí)際濃度在LOD–LOQ之間，則認(rèn)為可“定性檢測(cè)”；若實(shí)際濃度大于LOQ，則認(rèn)為可“定量測(cè)定”。

圖3 檢出限、定量限將濃度分為三個(gè)區(qū)域[18]

測(cè)定限(Limit of Determination，Determination Limit)為定量分析實(shí)際可能測(cè)定的某組分的下限[11]。因此，檢出限與定量限和測(cè)定限為三個(gè)不同的參數(shù)。

3 影響靈敏度的因素和提高靈敏度的策略

如前所述，靈敏度為單位濃度(或質(zhì)量)變化而引起的測(cè)量信號(hào)的變化(Sc= Δy/Δc，Sq= Δy/Δq)。對(duì)于信號(hào)增強(qiáng)法，其值為正；對(duì)于抑制法，其值為負(fù)。測(cè)定方法的靈敏度主要取決于測(cè)定體系物質(zhì)的性質(zhì)(包括溶液條件)、測(cè)定儀器參數(shù)和所用儀器設(shè)備等因素。

對(duì)于給定的化學(xué)和生物分析方法，測(cè)定物質(zhì)轉(zhuǎn)化為測(cè)量信號(hào)是關(guān)鍵因素。分析方法可分為直接法和間接法。直接法是直接利用待測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生的測(cè)量信號(hào)進(jìn)行測(cè)量的方法；間接法是將待測(cè)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可產(chǎn)生測(cè)量信號(hào)的物質(zhì)進(jìn)行測(cè)量的方法。以下影響因素和策略是針對(duì)產(chǎn)生測(cè)量信號(hào)的物質(zhì)進(jìn)行討論的。

1) 光度定量分析法

2) 熒光定量分析法

其定量公式為：If=2.3kφf(shuō)I0εbc。2.3kφf(shuō)I0εb即方法的靈敏度S。選擇熒光量子產(chǎn)率φf(shuō)大和ε大的物質(zhì)是提高S的關(guān)鍵；選擇入射光強(qiáng)度I0大和儀器參數(shù)k大的儀器和b大的測(cè)量池，也可提高S。使用激光光源可提高I0，也允許使用較大的b。好的熒光分光光度計(jì)有較好儀器放大因子k，也常受到青睞。

3) 伏安分析法

對(duì)于平面電極，線性掃描擴(kuò)散電流定量公式為Randles-Sevcik方程：ip= 2.69 × 105n3/2Do1/2Av1/2c。其中ip為峰電流(A)，n為轉(zhuǎn)移電子數(shù)，Do為擴(kuò)散系數(shù)(cm2?s?1)，A為電極面積(cm2)，v為掃描速率(V?s?1)，c為待測(cè)組分濃度(mol?cm?3，或mol?mL?1)。2.69 × 105n3/2Do1/2Av1/2即方法的靈敏度S。由此可見，增大電極面積A，增大掃描速率v，增大擴(kuò)散系數(shù)D等，則可增加峰電流。但是，應(yīng)注意測(cè)得的峰電流為殘余電流和擴(kuò)散電流之和。殘余電流主要包括雜質(zhì)電流和充電電流ic。充電電流ic= ACdv，式中Cd為電極的微分電容。由此可見，增大掃描速度，充電電流的增加比擴(kuò)散電流的增加更快，不利于檢出限的降低；但形式上增加了方法的靈敏度。

對(duì)于分析化學(xué)研究者，對(duì)于給定的體系，常常研究化學(xué)或生物信號(hào)放大策略以提高方法的靈敏度。例如，酶催化放大策略是利用檢測(cè)物的循環(huán)利用進(jìn)行物質(zhì)放大的策略；有些納米信號(hào)放大策略是利用納米材料對(duì)信號(hào)物質(zhì)的多負(fù)載提高測(cè)量信號(hào)的策略；生物信號(hào)放大策略如PCR是進(jìn)行檢測(cè)基因片段物質(zhì)放大的策略。又如，對(duì)于伏安法測(cè)定方法盡量設(shè)計(jì)成基于測(cè)量平行催化電流的方法，ica=nFAD1/2(kfcz)1/2c，式中kf為均相反應(yīng)速率常數(shù)，cz為氧化劑(或還原劑)濃度，c為待測(cè)物(催化劑)濃度。相對(duì)于擴(kuò)散電流體系或kf小的催化體系，選擇kf大的體系就可以提高靈敏度。

4 影響檢出限的因素和降低檢出限的策略

背景噪聲主要來(lái)源于儀器背景、化學(xué)背景和生物背景噪聲[19,20]。儀器背景噪聲主要來(lái)源于電子元件的噪聲，如光電倍增管的暗電流，可選擇暗電流小的光電倍增管；如溫度變化引起電子元件信號(hào)的波動(dòng)，可選擇恒溫體系減小此種波動(dòng)；又如伏安分析中外電場(chǎng)或磁場(chǎng)引起的電流波動(dòng)，可選擇法拉第籠減小外電場(chǎng)的干擾?；瘜W(xué)背景即為雜質(zhì)或未知物質(zhì)產(chǎn)生的微小信號(hào)。可通過(guò)提純?cè)噭┖腿軇﹣?lái)減小這類背景，也可以加入大量某種物質(zhì)使化學(xué)背景恒定而進(jìn)行扣除。在實(shí)際工作中，樣品中常常存在干擾物質(zhì)，干擾物質(zhì)產(chǎn)生的負(fù)干擾或正干擾并不屬于此類。生物背景主要來(lái)源于檢測(cè)生物體系(組織、細(xì)胞等)中未知物質(zhì)產(chǎn)生的微小信號(hào)。對(duì)于這類背景應(yīng)選擇標(biāo)準(zhǔn)的組織或細(xì)胞等，一般使產(chǎn)生的生物背景盡量恒定，再進(jìn)行扣除。

上述重點(diǎn)討論了與標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)的靈敏度和檢出限。在實(shí)際工作中，常常需要繪制工作曲線進(jìn)行定量分析。即根據(jù)實(shí)際樣品，并考慮消除各種干擾而加入合適的試劑或適當(dāng)?shù)馗淖儍x器測(cè)量參數(shù)繪制工作曲線。近年來(lái)，關(guān)于生物分析和生物傳感器中靈敏度和檢出限的討論備受關(guān)注[19–21]。在生物分析中，生物背景對(duì)分析結(jié)果影響最大。當(dāng)生物傳感器檢測(cè)實(shí)際生物樣品時(shí)，樣品基體中的生物大分子會(huì)干擾待測(cè)組分與傳感器之間的相互作用，導(dǎo)致傳感器的性能變差。例如，毛蘭群[19]指出，植入式傳感器在活體檢測(cè)一定時(shí)間后，由于周圍生物層的形成以及體內(nèi)的免疫反應(yīng)，會(huì)影響其分析性能，甚至出現(xiàn)信號(hào)異常和傳感器故障。在實(shí)際樣品中計(jì)算獲得待測(cè)物質(zhì)的檢出限可能高于標(biāo)準(zhǔn)溶液求得的檢出限。復(fù)雜生物樣品中的分析結(jié)果有時(shí)也會(huì)優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)溶液中的分析結(jié)果，例如，血樣中抗原與抗體的結(jié)合能力大于緩沖溶液中兩者的結(jié)合能力，在血樣中分析有利于免疫分析方法分析性能的提高[20]。因此，對(duì)于新建立的某一新分析方法的性能評(píng)價(jià)，應(yīng)報(bào)告該方法在標(biāo)準(zhǔn)溶液中以及在真實(shí)的樣品中的靈敏度和檢出限。因?yàn)楹笳吒泻蠈?shí)際分析。

本文剖析了靈敏度和檢出限的經(jīng)典定義及計(jì)算公式，討論了影響方法靈敏度和檢出限的因素，對(duì)提高靈敏度、降低檢出限提出了一些策略?？傮w而言，分析方法的靈敏度和檢出限，兩者相輔相成，不能孤立使用。本文旨在拋磚引玉，引起大家對(duì)方法靈敏度和檢出限的概念及影響因素的關(guān)注與思考，共同商討，以促進(jìn)兩者的規(guī)范使用。